4. Peaks识别与过滤

1.Peak检测:估计d值并进行shift

• 怎样得到两个peak间的距离d，即插入片段是多长？

答：双端：如果有10M的reads数，则求它们reads对的平均长度；

单端：如果是单末端，左端reads和右端reads是没有关系的，没法用这种简单方式估计reads的长度。将左边的峰往右边移，右边的峰往左边移，等两个峰几乎要重合了，移动的距离就是d/2。

• 软件：macs3
• 参数: --nomodel 不建模，建模就是软件自己估计插入片段长度的过程。

• macs3工作流程

2. narrow peak和broad peak

几乎所有的转录因子结合的峰都是narrow peak，很尖的峰。

3.macs3的使用

• 有效基因组大小：总长-N的数量

Q：算有效基因组大小，需要去除线粒体/叶绿体基因吗？

A：不需要单独去除线粒体/叶绿体，一般的fa文件里面不包含线粒体/叶绿体。如果有，则删除这两条序列。

• chip-seq中，input和对照的区别？

  • input: 在chip实验前，取一部分细胞裂解物，不进行免疫沉淀(IP)，直接进行DNA片段化和测序；（反应基因组背景，无选择性富集）
  • 对照：用非特异性抗体IgG进行chip实验。（反应非特异性结合和实验噪声）

• 各参数意思？

  • --format即-f，单端用-f BAM；双端用-f BAMPE；
  • --keep-dup，默认是1，则在这一步dedup，即若有多个长得一样的序列，算为1个；之前去除过，则用all，表示call peak中不再去重；
  • --qvalue, --pvalue，指在进行峰值检测的时候的QVALUE和PVALUE，代表检测的峰是对的还是错的一个可能性，设置的时候设置-q，不要设置-p。设置-p对峰值检测的准确性大大降低，在MACS3里，-q和-p是互斥的，在MACS3里，设置了p值就不算q值，设置了q值就不算p值。
  • --cutoff-analysis，用于--qvalue阈值的选择，让软件自己进行测试。设置之后，会慢30倍。

4.结果

score = -log10qvalue * 10