单细胞测序分析（一）软件安装&准备测序数据

数信院兔兔
3 阅读4分钟

大家好！上一期我们探讨了为什么要做单细胞转录组，揭示了单细胞技术如何打破传统测序的局限，解析细胞异质性的奥秘。本期我们将正式开启实战篇章，手把手教你搭建单细胞分析环境，并准备好测序数据，为后续分析打下坚实基础！

一、工欲善其事，必先利其器：软件安装指南

单细胞数据分析依赖专业的生物信息学工具，以下是几款必装核心软件及其安装方法：

上游分析软件

1. Cell Ranger（10x Genomics官方流程）

  • 作用：处理10x Genomics单细胞数据，完成原始序列（FASTQ）到基因表达矩阵的转换。

  • 安装步骤：

    # 下载安装包（需官网注册后获取下载链接）
wget https://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-9.0.1.tar.gz?Expires=1738974489&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA&Signature=VVeJRDheJ19IvquZ-MtHaIyvfEfsfePJKbhn8vxFCqQLjMUntK1LMQrHsVxN5EMLeU-ozzrxYyXng3hloSChYnEfpWmHVpM1vaHNWyBV9vB6JDMm-GojDVmAu6gVTrahV01SjKP9FhwUni6cnkVP9fofwmE3bHc92eVIAijC0AR3DdIMolVVUfj03VOmuTyWQvf5mgAXCGXbRtsEtVHMuAhndWFc8GS9kFKhH~pUfoqLyQAdY8ywEzp3zahxfqvsk~ax0TECq91AeGVqgaoNvbGa-8TIHkeSdfHOtkiQ3P3SnbnS8COlOyCrpB~1P0uMd9rf8Q4EOzRfSuPe3V-rhA__
# 解压并添加环境变量
tar -xzvf cellranger-9.0.1.tar.gz
echo 'export PATH=$PATH:/your/path/cellranger-9.0.1' >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc

  • 验证安装：cellranger testrun --id=tiny

  • 注意：写入环境变量替换路径和足够的存储空间（建议>50GB）。

CellRanger 常用命令如下：

  • Cell Ranger mkref 用于构建参考基因组
  • Cell Ranger mkfastq 用于将下机数据转换为 fastq，一般不需要
  • Cell Ranger count 用于表达定量
  • Cell Ranger aggr 用于整合多样本的表达矩阵### 下游分析软件

Seurat 和Scanpy是两个流行的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）分析工具，它们分别基于 R 和 Python 语言开发。两者在功能、性能、可扩展性和用户友好性等方面各有优劣，适合不同的科研需求。下面从几个关键维度对这两个工具进行比较：

比较维度SeuratScanpy
编程语言RPython
数据存储与处理Seurat 对象，适合小到中等规模的数据集AnnData，支持大规模数据集的内存外操作
计算性能适合中等规模数据集，处理大数据时较慢高效处理大规模数据集，支持稀疏矩阵
可视化使用 ggplot2 生成丰富的可视化图表，易于定制化基础的可视化，需要配合 matplotlib 等库使用
社区与生态系统活跃的 R 语言社区，有大量教程和相关 R 包支持基于 Python，易与机器学习库集成，生态系统广泛
工具集成与 R 包如 Monocle、SingleR 等集成良好与 Python 生态系统和深度学习工具（如 scVI）集成良好
易用性对 R 用户友好，生物学研究者常用对 Python 用户友好，学习曲线较陡峭，但对高级用户功能强大
Seurat 等 R 包

参考：satijalab.org/seurat/arti…

  • 作用：数据质控、降维聚类、差异基因分析及可视化等。
  • 安装方法（R/RStudio环境）：
 # Install the remotes package
if (!requireNamespace("remotes", quietly = TRUE)) {
  BiocManager::install("remotes")
}

# 基础包
BiocManager::install("dplyr")
BiocManager::install("tidyverse")
BiocManager::install("patchwork")
remotes::install_version("Matrix", version = "1.6-4")
BiocManager::install("irlba")
BiocManager::install("scater")

# Seurat 相关包
BiocManager::install("Seurat")
BiocManager::install("SeuratObject")
BiocManager::install("satijalab/seurat-data")
BiocManager::install('satijalab/seurat-wrappers')
BiocManager::install("satijalab/azimuth")
BiocManager::install('Signac')
BiocManager::install('tidyseurat')

# 其他包
BiocManager::install("chris-mcginnis-ucsf/DoubletFinder")
BiocManager::install("jinworks/CellChat")
devtools::install_github('cole-trapnell-lab/monocle3', ref="develop")

library(tidyverse)
library(patchwork)

library(Seurat)
library(SeuratObject)

library(SeuratData)
library(Azimuth)

library(monocle3)

安装了V5 版本需要再装 V4版本

remotes::install_version("Matrix", version = "1.6-1", lib = '/your/path/Seurat_V4')
remotes::install_version(package = 'Seurat', 
                         version = '4.4.0', 
                         lib = '/your/path/Seurat_V4')

remotes::install_version(package = 'SeuratObject', 
                         version = '4.1.4', 
                         lib = '/your/path/Seurat_V4')

library(Seurat, lib = "/your/path/Seurat_V4/")

library(SeuratObject, lib = "/your/path/Seurat_V4/")
```#### Scanpy（Python版单细胞分析工具）

-   **适用场景**：偏好Python的用户，支持大规模数据处理。

-   **安装命令**：

    ```
    pip install scanpy
    # 可选安装加速库
    pip install umap-learn leidenalg
    ```

* * *

## 二、准备测序数据

### 1. 获取原始数据

-   **来源**：公共数据库（如NCBI GEO、国家基因组中心）或实验室测序下机数据。
-   **常见格式**：
-   -   **FASTQ文件**：包含测序序列和碱基质量信息（文件命名通常含`R1`、`R2`）。
    -   **参考基因组**：需与物种和版本匹配（如人类`GRCh38`）。

* * *

### 2. 数据下载与校验（以GEO为例）

使用wget或sratoolkit下载

prefetch SRR1234567  # SRA编号示例 fasterq-dump SRR1234567 --split-files

校验MD5值（确保数据完整性）

md5sum SRR1234567_1.fastq.gz


* * *

### 3. 数据预处理（Cell Ranger流程）

-   **配置参考基因组**：

    ```
    cellranger mkref --genome=GRCh38 \
                     --fasta=GRCh38.fa \
                     --genes=genes.gtf
    ```

-   **运行分析流程**：

    ```
    cellranger count --id=sample1 \
                     --transcriptome=GRCh38 \
                     --fastqs=path/to/fastq \
                     --sample=Sample1
    ```

-   **输出结果**：`outs/filtered_feature_bc_matrix` 目录下的基因表达矩阵（后续分析的核心输入）。

* * *

## 三、避坑指南：常见问题与解决方案

1.  **依赖缺失**：安装前确保系统已安装`zlib`、`glibc`等库，推荐使用`conda/mamba`管理环境。
1.  **权限问题**：Linux用户注意`sudo`权限及文件读写权限。
1.  **存储不足**：单细胞数据庞大，建议预留充足硬盘空间（处理10x数据需>50GB）。

* * *

通过本期内容，你已经迈出了单细胞分析的第一步！

准备好数据和工具后，下一期我们将正式构建seurat对象。

如果你在安装中遇到问题，欢迎留言讨论！
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