在肿瘤微环境中，癌细胞究竟如何策反免疫细胞？
干细胞分化时，数万个基因如何上演精密"编程大戏"？
我们测的普通转录组通常是一个组织，但一个组织有很多种不同的细胞类型。我们关注的基因可能不是在所有基因中都表达，因为不同的细胞的功能不一样，那么基因的表达量就不一样。最后表达矩阵得出的基因的表达量是一个平均值，是不太合理的。单细胞转录组能够更好的区分基因在不同细胞中的表达情况。
本篇推文带你走进这个斩获2023《Science》年度突破的技术，看它如何颠覆疾病认知、打开精准医疗新维度。
单细胞发展史
单细胞RNA测序的诞生（2009年左右）
- Tang等人的开创性工作：2009年，Tang等人首次成功地对单个哺乳动物细胞进行全转录组测序，标志着单细胞RNA-seq技术的诞生。这项工作展示了从单个细胞中捕获并扩增mRNA信息的可行性，为后续技术的开发提供了技术验证和思路。
- 技术瓶颈：初期方法面临着低捕获率、扩增偏好性强等问题，导致数据噪音较大和覆盖度不足。
2011年第一个单细胞RNA高通量测序方法——名为STRT-seg的单细胞标记逆转录测序法被建立。次年，Smart-seg和CEL-seq也相继问世。基于Smart-seq技术改进的新技术被称为Smart-seq2，而10x Genomics则作为一种新型单细胞测序方法被开发出来。
每个细胞都是独特个体
传统转录组测序通常是一个组织，但一个组织有很多种不同的细胞类型。我们关注的基因可能不是在所有基因中都表达，因为不同的细胞的功能不一样，那么基因的表达量就不一样。最后表达矩阵得出的基因的表达量是一个平均值，是不太合理的。
单细胞转录组能够更好的区分基因在不同细胞中的表达情况。 它能：
- 不同细胞类型基因的表达模式是不同的（如根尖不同细胞类型）
- 胃癌患者胃中是否存在肠道类型的细胞
- 识别0.1%的稀有细胞（如循环肿瘤细胞）
- 绘制干细胞分化"命运抉择树"
- 发现全新细胞亚型（如2021年《Nature》揭示的神经退行性疾病特异性胶质细胞）
案例点睛：斯坦福团队通过分析5万个阿尔茨海默病脑细胞，意外发现引发神经元死亡的"幕后黑手"竟是一群伪装成保护细胞的"叛变星形胶质细胞"。
10X Genomics 技术原理
10X Genomics起源自Drop-Seq技术，该平台可通过快速高效的单细胞标记、测序和分析，获得单细胞水平的基因表达谱，对复杂细胞群体进行深入细致分析，绘制大规模单细胞表达图谱。与其他大规模单细胞分选平台相比，该平台通量高，周期快速，成本低，细胞捕获效率高，并且商业化仪器操作简便。但其对细胞活性要求较高，大于90%。
1号孔加细胞悬浮液
2号孔加磁珠
3号孔加油滴
将单个细胞与含有条形码（barcode）和引物（umi+ploy（dT）VN）的凝胶珠包裹在一个油滴。从横向孔道中逐一输入凝胶微珠，第一纵向孔道输入细胞，凝胶微珠（barcode+umi+ploy（dT）VN）与细胞碰撞后会吸附在凝胶微珠上，并通过微流控技术，将之输入到第二纵向孔道，即油相孔道中。这时候，就形成了一个个油滴，最终输出并收集在EP管中。每一个油滴中会落入一个细胞以及一个凝胶微珠，那么在每一个凝胶微珠中上长满了不同的Cell Barcode和UMI Barcode连接形成的序列，再加上一端PolyT的抓手，构成我们的捕获凝胶微珠。而这个凝胶微珠抓手就会使用oligo dT抓住mRNA构建文库。该过程可使细胞标记上特殊的barcode，从而达到单细胞测序的目的
每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA
液体油层破坏后，cDNA后续进行文库构建，使用Illumina测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据，10min内自动完成多至80,000个细胞的捕获，从而达到在单细胞水平进行表达测序的目的
重点
1.百分之六七十的油滴包裹一个细胞，也肯定有0个或者多个，需要在后续分析中去除
2.逆转录在油滴内完成
3.Barcode用于区分细胞（16nt）
4.UMI用于区RNA（12nt）,每个UMI之间至少相差2个碱基
5.PolyT用于结合mRNA（30nt）
文库构建-测序-表达定量
重点
Read1保护barcode和UMI信息
Read2包含转录本序列信息，用于比对到参考序列
Linux下使用Cell Ranger 软件进行比对和表达定量（表达矩阵）
技术迭代催生科研新范式
随着10x Genomics Chromium X系列实现百万级细胞通量、国产M20芯片将成本降低60%，2023年单细胞研究呈现爆发式增长：
- 全球新增2.4万篇相关论文（同比增长67%）
- 85个国家启动人类细胞图谱计划
- 单细胞数据库CellXGene收录超5000万细胞数据
科研利器：从空间转录组到多组学整合，从类器官建模到活细胞动态追踪，技术矩阵正在构建生命科学的"数字孪生"世界。
据BCC Research预测，全球单细胞分析市场将在2025年突破78亿美元。当前布局者已呈现三大趋势：
- 临床转化加速：FDA批准首款基于单细胞数据的AML分型试剂盒
- 跨界融合加深：AI算法DeepCell实现细胞类型自动注释
- 生态闭环成型：从样本采集→建库测序→云计算→临床解读的一站式解决方案
