英文标题： Deciphering mitochondrial dysfunction in keratoconus: Insights into ACSL4 from machine learning-based bulk and single-cell transcriptome analyses and experimental validation
中文标题： 解析圆锥角膜中线粒体功能障碍：基于机器学习的批量和单细胞转录组分析及实验验证对 ACSL4 的新见解
发表期刊： Computational and Structural Biotechnology Journal
研究思路：
[ 导读]
圆锥角膜（KC）是一种常见的角膜扩张性疾病，也是全球角膜移植的主要原因，而其发病机制目前尚不完全清楚。为揭示其发病机理，上海第九人民医院眼科团队联合纽科生物团队对这一难题展开攻关。研究表明，圆锥角膜的发生发展可能与线粒体功能异常相关。为此，联合团队以 KC 细胞的线粒体为研究切入点，获取了转录组学数据，并鉴定出差异表达基因。之后分析其潜在的功能通路和蛋白质互作网络（PPI），再用多种机器学习算法筛选并验证其中找到的枢纽基因ACSL4。
生物信息学分析显示，ACSL4 是圆锥角膜最具潜力的生物标志物，主要在角膜基质细胞中表达。体外实验进一步证实，ACSL4 在 KC 进展中发挥关键作用。这些发现揭示了 KC 发病中与线粒体相关的分子机制，而关键生物标志物 ACSL4 的鉴定为 KC 的机制研究和治疗探索提供了新方向。以下将详细解析该研究的技术路线。
[ 初筛生物标志物]
利用人角膜基质细胞模型进行高通量 RNA 测序后，筛选出 2910 个下调和 526 个上调的差异表达基因（DEGs）。基于这些 DEGs 构建了包含 104 个节点的 PPI 网络，同时开展全面的基因本体论（GO）分析和 KEGG 分析。结果显示，氧化应激、凋亡、铁死亡及多种免疫反应等与线粒体功能障碍密切相关的通路，共同参与圆锥角膜的发病机制。依据上述分析，最终筛选出 33 个候选生物标志物。
图1. 对候选生物标志的初步筛选
[ 机器学习筛选标志物]
尽管已获得 33 个候选标志物，但逐一验证的成本依然高昂。为进一步筛选，作者采用机器学习方法，分别运用 LASSO 和 SVM-RFE 两种算法进行筛选，得到 9 个和 14 个候选基因。经验证，最终确定 CYP24A1、ACSL4、ACADL、HELZ2、AMT、DEPTOR、TUBA1A、TYMS 和 ACSL5 为枢纽基因。
图2. 通过多种机器学习模型筛选和验证枢纽基因
[ 多维度批量分析，精确定位枢纽基因]
为探索圆锥角膜的潜在调控机制，基于 9 个枢纽基因并结合多个数据库结果构建了多因子互作网络。近年研究表明，转录因子和 miRNA 在调控中起关键作用，因此该网络除 9 个候选因子外，还纳入 26 个 miRNA 和 22 个转录因子。联合团队进一步对圆锥角膜单细胞数据进行降维分析，最终提出 ACSL4 是圆锥角膜最具潜力生物标志物的结论。
图3. 多因子相互作用网络
图4. UMAP降维分析
[ 体外实验，理论与实践相结合]
最后，研究团队分别采用免疫浸润分析和细胞模型转录组学分析方法，对生物信息学分析结论进行验证。多种验证结果显示，ACSL4 在圆锥角膜细胞的免疫通路中发挥重要作用，并揭示其可能作为圆锥角膜发展中的潜在机械敏感调节因子，将生物力学应激与线粒体功能障碍相联系。
图5.对ACSL4的功能验证
[ 总结]
在这项研究中，联合团队综合运用生物信息学分析与体外实验方法，筛选并验证圆锥角膜的关键标志物。生物信息学层面，纽科生物团队通过高通量测序、PPI 网络构建、功能富集分析及机器学习等手段，成功定位 9 个关键标志物，并从中筛选出最具潜力的基因 ACSL4。进一步研究发现，ACSL4 与免疫细胞浸润密切相关，且在铁死亡、氧化应激及机械转导过程中发挥重要作用，揭示其作为连接机械应激与线粒体功能障碍的关键节点。该研究证实 ACSL4 可作为 KC 早期诊断的生物标志物，为临床非手术治疗提供新思路。
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