# 需要把 C:\Program Files\Git\usr\bin 目录添加到系统环境变量
# 文件资源管理器——此电脑——属性——高级系统设置——环境变量——系统变量——Path——编辑——新建——填写“C:\Program Files\Git\usr\bin”——确定——确定——确定
# 注意win10系统是一个目录一行；win7中多个目录用分号分隔，注意向后添加目录
8. usearch -alpha_div_rare结果前两行出现“-”
#问题：抽样0时补“-”，且缺失制表符
#处理：替换“-”为"制作符\t+0"即可恢复
cd /c/amplicon/FAQ/08rare
sed "s/-/\t0.0/g" alpha_rare_wrong.txt\
> alpha_rare.txt
9. 物种注释otus.sintax方向全为“-”，需要序列取反向互补
#是原始序列方向错误，将filtered.fa序列需要取反向互补。再从头开始分析
cd /c/amplicon/FAQ/09revcom
vsearch --fastx_revcomp filtered_RC.fa \
--fastaout filtered.fa
10. windows换行符查看和删除
#Windows换行符为换行($)+^M，等于Linux换行+mac换行。分析数据中以linux格式为通用标准，因此windows中如excel编写并存为文本文件(制表符分隔)(*.txt)的表格，行尾有不可见的^M符号，导致分析出错。可使用cat -A命令查看此符号，可用sed删除。
cd /c/amplicon/FAQ/10^M
# 查看行尾是否有^M
cat -A metadata.txt
# 删除^M，并写入新文件
sed 's/\r//' metadata.txt > metadata.mod.txt
# 检查是否成功
cat -A metadata.mod.txt
# 直接原文件删除
sed -i 's/\r//' metadata.txt
11. UNITE数据库分析报错
#USEARCH使用UNITE下载的utax数据库，提示各种错误
cd /c/amplicon/FAQ/11unite
# 解压Unite的useach使用物种注释库
gunzip -c utax_reference_dataset_all_04.02.2020.fasta.gz > unite.fa
# 对ITS序列进行注释，默认阈值0.8
usearch --sintax otus.fa \
--db unite.fa \
--tabbedout otus.sintax --strand plus
--sintax_cutoff 0.6
#报错信息如下：
---Fatal error---
Missing x: in name >JN874928|SH1144646.08FU;tax=d:Metazoa,p:Cnidaria,c:Hydrozoa,o:Trachylina,f:,g:Craspedacusta,s:Craspedacusta_sowerbii_SH1144646.08FU;
“Unprintable ASCII character no 195 on or right before line 236492”
# 分析原因为分类级存在空缺。可用sed补全即可解决
# 分类级存在空缺，sed补全
sed -i 's/,;/,Unnamed;/;s/:,/:Unnamed,/g' unite.fa
# 再运行前面usearch --sintax命令
#注：vsearch有问题，推荐用usearch，结尾添加--strand plus才能成功运行
12. Windows的Linux子系统本地安装qiime2
# 详见 qiime2/pipeline_qiime2.sh
n=qiime2-2023.2
# 安装包下载链接
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/conda/${n}.tar.gz
# 新环境安装
mkdir -p ~/miniconda3/envs/${n}
tar -xzf ${n}.tar.gz -C ~/miniconda3/envs/${n}
# 激活并初始化环境
conda activate ${n}
conda unpack
13. RDP 16-18注释结果比较
# 统计序列中门的数量，从60降为39
grep '>' ${db}/usearch/rdp_16s_v16_sp.fa|cut -f2 -d ';'|cut -f1-2 -d ','|sort|uniq|wc -l
grep '>' ${db}/usearch/rdp_16s_v18.fa|cut -f2 -d ';'|cut -f1-2 -d ','|sort|uniq|wc -l
# 统计序列中属的数量，从2517增长为3061
grep '>' ${db}/usearch/rdp_16s_v16_sp.fa|cut -f2 -d ';'|cut -f1-6 -d ','|sort|uniq|wc -l
grep '>' ${db}/usearch/rdp_16s_v18.fa|cut -f2 -d ';'|cut -f1-6 -d ','|sort|uniq|wc -l
cd /c/amplicon/FAQ/13rdp16_18
# 门由15个降为13个
tail -n+2 rdp16_sintax.txt|cut -f3|sort|uniq -c|wc -l
tail -n+2 rdp18_sintax.txt|cut -f3|sort|uniq -c|wc -l
# 属由176个降为144个
tail -n+2 rdp16_sintax.txt|cut -f7|sort|uniq -c|wc -l
tail -n+2 rdp18_sintax.txt|cut -f7|sort|uniq -c|wc -l
14. usearch生成OTU表小样本比vsearch更快
# usearch生成特征表，小样本(<30)快；但大样本受限且多线程效率低，83.2%, 4核17s
time usearch -otutab temp/filtered.fa \
-otus result/raw/otus.fa \
-threads 4 \
-otutabout result/raw/otutab.txt
# vsearch比对，更准更慢，但并行24-96线程更强
vsearch --usearch_global temp/filtered.fa --db ${db}/gg/97_otus.fa \
--otutabout result/gg/otutab.txt --id 0.97 --threads 12
# 比对率81.04%, 1核30m, 12核7m
版本更新记录
- 2021/4/3 EasyAmplicon 1.11:
- R包amplicon升级为 1.11.0，解决metadata两列报错的问题。
- 调整课程顺序，每天上午9点-12点2节，下午1点半-6点3节。
- 提供附加课程Supp目录。
- 2021/7/23 EasyAmplicon 1.12:
- R运行环境升级为4.1.0，配套有4.1.zip的全套包
- R包amplicon升级为 1.12.0，alpha_boxplot去掉Y轴的index
- alpha_boxplot.R增加标准化、转置等参数，可用于绘制任何特征箱线图
- beta_pcoa/cpcoa.R增加控制椭圆、标签显示等参数
- tax_stackplot.R增加多种配色方案
- picurst流程更新，并提供打包的conda下载
- picurst2新增KO合并为KEGG通路1-3级代码，并提供打包的conda下载
- 随机森林：提供分类级筛选、随机数筛选、可视化代码
- 2021/10/15 EasyAmplicon 1.13:
- R运行环境升级为4.1.1，配套有4.1.zip的最新全套包
- 元数据方差分解PERMANOVA：在Diversity-tutorial.Rmd中Beta多样性分析中新增adonis计算变量对群落的解析率和显著性分析
- 树图treemap升级后无颜色，改为代码供参考，并在Diversity_tutrial.Rmd中删除此部分
- alpha_boxplot输出无默认目录，可指定文件名头，添加无ID报错注释
- 2022/1/7 EasyAmplicon 1.14:
- R运行环境升级为4.1.2，配套有4.1.zip的最新全套包
- RStudio更新为2021.09.1
- 文涛重写amplicon包中tax_maptree函数，不依赖其他包，解决无法着色问题
- EasyMicrobiome中添加compare_stamp.R脚本，直接差异比较绘制STAMP扩展柱状图；代码详见result/CompareStamp.Rmd
- EasyMicrobiome中添加compare_hierarchy_facet.R和compare_hierarchy_facet2.R，展示KEGG的1，2级总览和差异
- 更新高级分析目录advanced：包括环境因子、马尔可无链、网络模块、网络比较、随机森林分类、随机森林回归、微生态等
- 2023/2/3 EasyAmplicon 1.18:
- R运行环境升级为4.2.2，配套有4.2.zip的最新全套包
- RStudio更新为2022.12.0
- amplicon、EasyAmplicon和EasyMicrobiome更新为1.18
- QIIME 2更新为v2023.2
- vsearch更新为v2.22.1
- 新增ggClusterNet课程-文涛
- 2023/10/13 EasyAmplicon 1.20:
- R运行环境升级为4.3.1，配套有4.3.zip的最新全套包
- RStudio更新为2023.12.0
- amplicon、EasyAmplicon和EasyMicrobiome更新为1.20
- QIIME 2更新为v2023.7，数据库更新为greengene2 2022.10
- 新增ggpicrust2分析picrust2结果可视化
- 更新FAPROTAX为1.2.7
每季度视频课程安排：www.ehbio.com/trainLongTe…
使用此脚本，请引用下文：
If used this script, please cited:
Yong-Xin Liu, Lei Chen, Tengfei Ma, et al. 2023. EasyAmplicon: An easy-to-use, open-source, reproducible, and community-based pipeline for amplicon data analysis in microbiome research. iMeta 2: e83. doi.org/10.1002/imt…
Copyright 2016-2023 Yong-Xin Liu liuyongxin@caas.cn, Tao Wen taowen@njau.edu.cn, Tong Chen chent@nrc.ac.cn
**宏基因组学分析流程，绝对值得参考**
易宏基因组流程 EasyMetagenome Pipeline
# 版本Version: 1.20, 2023/11/23
# 操作系统Operation System: Linux Ubuntu 22.04+ / CentOS 7.7+
一、数据预处理 Data preprocessing
1.1 准备工作 Preparing
- 首次使用请参照
0Install.sh脚本，安装软件和数据库(大约1-3天，仅一次) - 易宏基因组(EasyMetagenome)流程
1Pipeline.sh复制到项目文件夹，如本次为meta - 项目文件夹准备测序数据(seq/*.fq.gz)和样本元数据(result/metadata.txt)
环境变量设置 Environment variable settings 分析前必须运行，设置数据库、软件和工作目录
# Conda软件安装目录，`conda env list`查看，如/anaconda3
soft=~/miniconda3
# 数据库database(db)位置，如管理员/db，个人~/db
db=~/db
# 设置工作目录work directory(wd)，如meta
wd=~/meta
# 创建并进入工作目录
mkdir -p $wd && cd $wd
# 创建3个常用子目录：序列，临时文件和结果
mkdir -p seq temp result
# 添加分析所需的软件、脚本至环境变量，添加至~/.bashrc中自动加载
PATH=$soft/bin:$soft/condabin:/usr/local/sbin:/usr/local/bin:/usr/sbin:/usr/bin:/sbin:/bin:$db/EasyMicrobiome/linux:$db/EasyMicrobiome/script
echo $PATH
元数据和序列文件 Metadata and Sequence Files
元数据
# 上传元数据metadata.txt至result目录，此处下载并重命名
wget http://www.imeta.science/github/EasyMetagenome/result/metadata.txt
mv metadata.txt result/metadata.txt
# 检查文件格式，^I为制表符，$为Linux换行，^M$为Windows回车，^M为Mac换行符
cat -A result/metadata.txt
# 根据样本文件生成元数据，可筛选子集，如EB开头
ls seq/EB*|grep '_1'|cut -f1 -d '_'|cut -f 2 -d '/'|sed'1 i SampleID'>result/metadataEB.txt
cp result/metadataEB.txt result/metadata.txt
# 元数据细节优化
# 转换Windows回车为Linux换行
sed -i 's/\r//' result/metadata.txt
# 去除数据中的一个多余空格
sed -i 's/Male /Male/' result/metadata.txt
cat -A result/metadata.txt
序列文件
# 用户使用filezilla上传测序文件至seq目录，本次从网络下载
# seq 目录下已经有测试文件，下载跳过
cd seq/
awk '{system("wget -c http://www.imeta.science/github/EasyMetagenome/seq/"$1"_1.fq.gz")}' <(tail -n+2 ../result/metadata.txt)
awk '{system("wget -c http://www.imeta.science/github/EasyMetagenome/seq/"$1"_2.fq.gz")}' <(tail -n+2 ../result/metadata.txt)
cd ..
# ls查看文件大小，-l 列出详细信息 (l: list)，-sh 显示人类可读方式文件大小 (s: size; h: human readable)
ls -lsh seq/*.fq.gz
序列文件格式检查 zless/zcat查看可压缩文件，检查序列质量格式(质量值大写字母为标准Phred33格式，小写字母为Phred64，需参考附录：质量值转换)；检查双端序列ID是否重名，如重名需要改名。参考附录 —— 质控kneaddata，去宿主后双端不匹配；序列改名。
# 设置某个样本名为变量i，以后再无需修改
i=C1
# zless查看压缩文件，空格翻页，q退出; head指定显示行数
zless seq/${i}_1.fq.gz | head -n4
工作目录和文件结构总结
# ├── pipeline.sh
# ├── result
# │ └── metadata.txt
# ├── seq
# │ ├── C1_1.fq.gz
# │ ├── ...
# │ └── N1_2.fq.gz
# └── temp
- 1pipeline.sh是分析流程代码；
- seq目录中有2个样本Illumina双端测序，4个序列文件；
- temp是临时文件夹，存储分析中间文件，结束可全部删除节约空间
- result是重要节点文件和整理化的分析结果图表，
- 实验设计metadata.txt也在此
1.2 Fastp质量控制 Quality Control
# 创建目录，记录软件版本和引文
mkdir -p temp/qc result/qc
fastp
# 单样本质控
i=C1
fastp -i seq/${i}_1.fq.gz -I seq/${i}_2.fq.gz \
-o temp/qc/${i}_1.fastq -O temp/qc/${i}_2.fastq
# 多样本并行
# -j 2: 表示同时处理2个样本
time tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|rush -j 2 \
"fastp -i seq/{1}_1.fq.gz -I seq/{1}_2.fq.gz \
-j temp/qc/{1}_fastp.json -h temp/qc/{1}_fastp.html \
-o temp/qc/{1}_1.fastq -O temp/qc/{1}_2.fastq \
> temp/qc/{1}.log 2>&1 "
# 质控后结果汇总
echo -e "SampleID\tRaw\tClean" > temp/fastp
for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do
echo -e -n "$i\t" >> temp/fastp
grep 'total reads' temp/qc/${i}.log|uniq|cut -f2 -d ':'|tr '\n' '\t' >> temp/fastp
echo "" >> temp/fastp
done
sed -i 's/ //g;s/\t$//' temp/fastp
# 按metadata排序
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"}NR==FNR{a[$1]=$0}NR>FNR{print a[$1]}' temp/fastp result/metadata.txt \
> result/qc/fastp.txt
cat result/qc/fastp.txt
1.3 KneadData去宿主 Host removal
kneaddata是流程主要依赖bowtie2比对宿主，然后筛选非宿主序列用于下游分析。
# 创建目录、启动环境、记录版本
mkdir -p temp/hr
conda activate kneaddata
kneaddata --version # 0.12.0
多样品并行去宿主，16p 4h
time tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|rush -j 2 \
"sed '1~4 s/ 1:/.1:/;1~4 s/$/\/1/' temp/qc/{}_1.fastq > /tmp/{}_1.fastq; \
sed '1~4 s/ 2:/.1:/;1~4 s/$/\/2/' temp/qc/{}_2.fastq > /tmp/{}_2.fastq; \
kneaddata -i1 /tmp/{1}_1.fastq -i2 /tmp/{1}_2.fastq \
-o temp/hr --output-prefix {1} \
--bypass-trim --bypass-trf --reorder \
--bowtie2-options '--very-sensitive --dovetail' \
-db ${db}/kneaddata/human/hg37dec_v0.1 \
--remove-intermediate-output -v -t 3; \
rm /tmp/{}_1.fastq /tmp/{}_2.fastq"
# * 匹配任意多个字符，？ 匹配任意一个字符
ls -shtr temp/hr/*_paired_?.fastq
简化改名
# Ubuntu系统改名
rename 's/paired_//' temp/hr/*.fastq
# CentOS系统改名
rename 'paired_' '' temp/hr/*.fastq
大文件清理，高宿主含量样本可节约>90%空间
# 使用命令的绝对路径确保使用无参数的命令，管理员用alias自定义命令含参数，影响操作结果
/bin/rm -rf temp/hr/*contam* temp/hr/*unmatched* temp/hr/reformatted* temp/hr/_temp*
ls -l temp/hr/
质控结果汇总
kneaddata_read_count_table --input temp/hr \
--output temp/kneaddata.txt
# 筛选重点结果列
cut -f 1,2,5,6 temp/kneaddata.txt | sed 's/_1_kneaddata//' > result/qc/sum.txt
# 对齐方式查看表格
csvtk -t pretty result/qc/sum.txt
二、基于读长分析 Read-based (HUMAnN3+MetaPhlAn4+Kraken2)
2.1 准备HUMAnN输入文件
HUMAnN要求双端序列合并的文件作为输入，for循环根据实验设计样本名批量双端序列合并。注意星号(*)和问号(?)，分别代表多个和单个字符。当然大家更不能溜号，行分割的代码行末有一个\
mkdir -p temp/concat
# 双端合并为单个文件
for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do
cat temp/hr/${i}_?.fastq \
> temp/concat/${i}.fq; done
# 查看样品数量和大小
ls -shl temp/concat/*.fq
# 数据太大，计算时间长，可用head对单端分析截取20M序列，即3G，行数为80M行，详见附录：HUMAnN2减少输入文件加速
2.2 HUMAnN计算物种和功能组成
- 物种组成调用MetaPhlAn4
- 输入文件：temp/concat/*.fq 每个样品质控后双端合并后的fastq序列
- 输出文件：temp/humann3/ 目录下
- C1_pathabundance.tsv
- C1_pathcoverage.tsv
- C1_genefamilies.tsv
- 整合后的输出：
- result/metaphlan4/taxonomy.tsv 物种丰度表
- result/metaphlan4/taxonomy.spf 物种丰度表（用于stamp分析）
- result/humann3/pathabundance_relab_unstratified.tsv 通路丰度表
- result/humann3/pathabundance_relab_stratified.tsv 通路物种组成丰度表
- stratified(每个菌对此功能通路组成的贡献)和unstratified(功能组成)
启动humann3环境，检查数据库配置
conda activate humann3
# 备选source加载指定环境
# source ~/miniconda3/envs/humann3/bin/activate
mkdir -p temp/humann3
humann --version # v3.7
humann_config
单样本1.25M PE150运行测试，8p，2.5M，1~2h；0.2M, 34m；0.1M，30m；0.01M，25m；16p，18m
i=C1
# 3p,26m; 数据库使用ssd缩短到19m；16p,8m
time humann --input temp/concat/${i}.fq --output temp/humann3 --threads 3 --metaphlan-options '--bowtie2db /db/metaphlan4 --index mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212 --offline'
多样本并行计算，测试数据约30m，推荐16p，3小时/样本
# 如果服务器性能好，请设置--threads值为8/16/32
tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f1 | rush -j 2 \
"humann --input temp/concat/{1}.fq \
--output temp/humann3/ --threads 3 --metaphlan-options '--bowtie2db /db/metaphlan4 --index mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212 --offline'"
# 移动重要文件至humann3目录
# $(cmd) 与 `cmd` 通常是等价的；`cmd`写法更简单，但要注意反引号是键盘左上角ESC下面的按键，$(cmd)更通用，适合嵌套使用
for i in $(tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f1); do
mv temp/humann3/${i}_humann_temp/${i}_metaphlan_bugs_list.tsv temp/humann3/
done
# 删除临时文件，极占用空间
/bin/rm -rf temp/concat/* temp/humann3/*_humann_temp
(可选)单独运行MetaPhlAn4
mkdir -p temp/humann3
i=C1
# 仅物种注释极快4p, 2m, 1m读取数据库
time metaphlan --input_type fastq temp/qc/${i}_1.fastq \
temp/humann3/${i}.txt --bowtie2db /db/metaphlan4 --index mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212 --offline \
--nproc 4
2.3 物种组成表
样品结果合并
mkdir -p result/metaphlan4
# 合并、修正样本名、预览
merge_metaphlan_tables.py temp/humann3/*_metaphlan_bugs_list.tsv | \
sed 's/_metaphlan_bugs_list//g' | tail -n+2 | sed '1 s/clade_name/ID/' | sed '2i #metaphlan4'> result/metaphlan4/taxonomy.tsv
csvtk -t stat result/metaphlan4/taxonomy.tsv
head -n5 result/metaphlan4/taxonomy.tsv
转换为stamp的spf格式
# metaphlan4较2增加更多unclassified和重复结果，用sort和uniq去除
metaphlan_to_stamp.pl result/metaphlan4/taxonomy.tsv \
|sort -r | uniq > result/metaphlan4/taxonomy.spf
head result/metaphlan4/taxonomy.spf
# STAMP不支持unclassified，需要过滤掉再使用
grep -v 'unclassified' result/metaphlan4/taxonomy.spf > result/metaphlan4/taxonomy2.spf
# 下载metadata.txt和taxonomy2.spf使用stamp分析
2.4 功能组成分析
功能组成样本合并合并
mkdir -p result/humann3
humann_join_tables --input temp/humann3 \
--file_name pathabundance \
--output result/humann3/pathabundance.tsv
# 样本名调整：删除列名多余信息
sed -i 's/_Abundance//g' result/humann3/pathabundance.tsv
# 统计和预览
csvtk -t stat result/humann3/pathabundance.tsv
head -n5 result/humann3/pathabundance.tsv
标准化为相对丰度relab(1)或百万比cpm(1,000,000)
humann_renorm_table \
--input result/humann3/pathabundance.tsv \
--units relab \
--output result/humann3/pathabundance_relab.tsv
head -n5 result/humann3/pathabundance_relab.tsv
分层结果：功能和对应物种表(stratified)和功能组成表(unstratified)
humann_split_stratified_table \
--input result/humann3/pathabundance_relab.tsv \
--output result/humann3/
差异比较和柱状图
两样本无法组间比较，在pcl层面替换为HMP数据进行统计和可视化。
- 输入数据：通路丰度表格 result/humann3/pathabundance.tsv和实验设计 result/metadata.txt
- 中间数据：包含分组信息的通路丰度表格文件 result/humann3/pathabundance.pcl
- 输出结果：result/humann3/associate.txt
在通路丰度中添加分组
## 提取样品列表
head -n1 result/humann3/pathabundance.tsv | sed 's/# Pathway/SampleID/' | tr '\t' '\n' > temp/header
## 对应分组，本示例分组为第2列($2)，根据实际情况修改
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"}NR==FNR{a[$1]=$2}NR>FNR{print a[$1]}' result/metadata.txt temp/header | tr '\n' '\t'|sed 's/\t$/\n/' > temp/group
# 合成样本、分组+数据
cat <(head -n1 result/humann3/pathabundance.tsv) temp/group <(tail -n+2 result/humann3/pathabundance.tsv) \
> result/humann3/pathabundance.pcl
head -n5 result/humann3/pathabundance.pcl
tail -n5 result/humann3/pathabundance.pcl
组间比较，样本量少无差异，结果为4列的文件：通路名字，通路在各个分组的丰度，差异P-value，校正后的Q-value。 演示数据2样本无法统计，此处替换为HMP的结果演示统计和绘图(上传hmp_pathabund.pcl，替换pathabundance.pcl为hmp_pathabund.pcl)。
wget -c http://www.imeta.science/github/EasyMetagenome/result/humann2/hmp_pathabund.pcl
/bin/cp -f hmp_pathabund.pcl result/humann3/
# 设置输入文件名
pcl=result/humann3/hmp_pathabund.pcl
# 统计表格行、列数量
csvtk -t stat ${pcl}
head -n3 ${pcl} | cut -f 1-5
# 按分组KW检验，注意第二列的分组列名
humann_associate --input ${pcl} \
--focal-metadatum Group --focal-type categorical \
--last-metadatum Group --fdr 0.05 \
--output result/humann3/associate.txt
wc -l result/humann3/associate.txt
head -n5 result/humann3/associate.txt
barplot展示通路的物种组成，如：腺苷核苷酸合成
# 指定差异通路，如 P163-PWY，--sort sum metadata 按丰度和分组排序
path=P163-PWY
humann_barplot \
--input ${pcl} --focal-feature ${path} \
--focal-metadata Group --last-metadata Group \
--output result/humann3/barplot_${path}.pdf --sort sum metadata
KEGG注释
支持GO、PFAM、eggNOG、level4ec、KEGG的D级KO等注释，详见humann_regroup_table -h。
# 转换基因家族为KO(uniref90_ko)，可选eggNOG(uniref90_eggnog)或酶(uniref90_level4ec)
for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do
humann_regroup_table \
-i temp/humann3/${i}_genefamilies.tsv \
-g uniref90_ko \
-o temp/humann3/${i}_ko.tsv
done
# 合并，并修正样本名
humann_join_tables \
--input temp/humann3/ \
--file_name ko \
--output result/humann3/ko.tsv
sed -i '1s/_Abundance-RPKs//g' result/humann3/ko.tsv
tail result/humann3/ko.tsv
# 与pathabundance类似，可进行标准化renorm、分层stratified、柱状图barplot等操作
# 分层结果：功能和对应物种表(stratified)和功能组成表(unstratified)
humann_split_stratified_table \
--input result/humann3/ko.tsv \
--output result/humann3/
wc -l result/humann3/ko*
# KO合并为高层次L2, L1通路代码KO to level 1/2/3
summarizeAbundance.py \
-i result/humann3/ko_unstratified.tsv \
-m ${db}/EasyMicrobiome/kegg/KO1-4.txt \
-c 2,3,4 -s ',+,+,' -n raw \
-o result/humann3/KEGG
wc -l result/humann3/KEGG*
2.5 GraPhlAn图
# metaphlan2 to graphlan
conda activate humann2
export2graphlan.py --skip_rows 1,2 -i result/metaphlan4/taxonomy.tsv \
--tree temp/merged_abundance.tree.txt \
--annotation temp/merged_abundance.annot.txt \
--most_abundant 1000 --abundance_threshold 20 --least_biomarkers 10 \
--annotations 3,4 --external_annotations 7
# 参数说明见PPT，或运行 export2graphlan.py --help
# graphlan annotation
graphlan_annotate.py --annot temp/merged_abundance.annot.txt \
temp/merged_abundance.tree.txt temp/merged_abundance.xml
# output PDF figure, annoat and legend
graphlan.py temp/merged_abundance.xml result/metaphlan4/graphlan.pdf \
--external_legends
# GraPhlAn Plot(测试中)
graphlan_plot.r --input result/metaphlan4/taxonomy.spf \
--design result/metadata.txt --number 100 \
--group all --type heatmap \
--output result/metaphlan4/heatmap
2.6 LEfSe差异分析物种
- 输入文件：物种丰度表result/metaphlan2/taxonomy.tsv
- 输入文件：样品分组信息 result/metadata.txt
- 中间文件：整合后用于LefSe分析的文件 result/metaphlan2/lefse.txt，这个文件可以提供给www.ehbio.com/ImageGP 用于在线LefSE分析
- LefSe结果输出：result/metaphlan2/目录下lefse开头和feature开头的文件
前面演示数据仅有2个样本，无法进行差异比较。下面使用result12目录中由12个样本生成的结果表进行演示
# 设置结果目录，自己的数据使用result，演示用result12
result=result12
# 如果没有，请下载演示数据
wget -c http://www.imeta.science/db/EasyMetagenome/result12.zip
unzip result12.zip
准备输入文件，修改样本品为组名(可手动修改)
# 提取样本行替换为每个样本一行，修改ID为SampleID
head -n1 $result/metaphlan2/taxonomy.tsv|tr '\t' '\n'|sed '1 s/ID/SampleID/' >temp/sampleid
head -n3 temp/sampleid
# 提取SampleID对应的分组Group(假设为metadata.txt中第二列$2)，替换换行\n为制表符\t，再把行末制表符\t替换回换行
awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"}NR==FNR{a[$1]=$2}NR>FNR{print a[$1]}' $result/metadata.txt temp/sampleid|tr '\n' '\t'|sed 's/\t$/\n/' >groupid
cat groupid
# 合并分组和数据(替换表头)
cat groupid <(tail -n+2 $result/metaphlan2/taxonomy.tsv) > $result/metaphlan2/lefse.txt
head -n3 $result/metaphlan2/lefse.txt
方法1. 推荐在线 www.bic.ac.cn/ImageGP/ 中LEfSe一键分析
方法2. LEfSe命令行分析
conda activate lefse
result=result12
# 格式转换为lefse内部格式
lefse-format_input.py $result/metaphlan2/lefse.txt \
temp/input.in -c 1 -o 1000000
# 运行lefse(样本必须有重复和分组)
run_lefse.py temp/input.in temp/input.res
# 绘制物种树注释差异
lefse-plot_cladogram.py temp/input.res \
$result/metaphlan2/lefse_cladogram.pdf --format pdf
# 绘制所有差异features柱状图
lefse-plot_res.py temp/input.res \
$result/metaphlan2/lefse_res.pdf --format pdf
# 绘制单个features柱状图
# 查看显著差异features，按丰度排序
grep -v '-' temp/input.res | sort -k3,3n
# 手动选择指定feature绘图，如Firmicutes
lefse-plot_features.py -f one --format pdf \
--feature_name "k__Bacteria.p__Firmicutes" \
temp/input.in temp/input.res \
$result/metaphlan2/lefse_Firmicutes.pdf
# 批量绘制所有差异features柱状图
lefse-plot_features.py -f diff \
--archive none --format pdf \
temp/input.in temp/input.res \
$result/metaphlan2/lefse_
2.7 Kraken2+Bracken物种注释和丰度估计
Kraken2可以快速完成读长(read)层面的物种注释和定量，还可以进行重叠群(contig)、基因(gene)、宏基因组组装基因组(MAG/bin)层面的序列物种注释。
# 启动kraken2工作环境
conda activate kraken2
# 记录软件版本
kraken2 --version # 2.1.2
mkdir -p temp/kraken2
Kraken2物种注释
输入：temp/qc/{1}_?.fastq 质控后的数据，{1}代表样本名； 参考数据库：-db ${db}/kraken2/pluspfp16g/ 输出结果：每个样本单独输出，temp/kraken2/中的{1}_report和{1}_output 整合物种丰度表输出结果：result/kraken2/taxonomy_count.txt
(可选) 单样本注释，5m，50G大数据库较5G库注释比例提高10~20%。以C1为例，在2023/3/14版中，8g: 31.75%; 16g: 52.35%; 150g: 71.98%；同为16g，2023/10/9版本为63.88%
# 根据电脑内存由小到大选择下面3个数据库
# pluspf16g/pluspfp(55G)/plusppfp(120G)
i=C1
time kraken2 --db ${db}/kraken2/pluspf16g/ \
--paired temp/qc/${i}_?.fastq \
--threads 2 --use-names --report-zero-counts \
--report temp/kraken2/${i}.report \
--output temp/kraken2/${i}.output
多样本并行生成report，1样本8线程逐个运行，内存大但速度快，不建议用多任务并行
for i in `tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f1`;do
kraken2 --db ${db}/kraken2/pluspf16g \
--paired temp/qc/${i}_?.fastq \
--threads 2 --use-names --report-zero-counts \
--report temp/kraken2/${i}.report \
--output temp/kraken2/${i}.output; done
使用krakentools转换report为mpa格式
for i in `tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f1`;do
kreport2mpa.py -r temp/kraken2/${i}.report \
--display-header -o temp/kraken2/${i}.mpa; done
合并样本为表格
mkdir -p result/kraken2
# 输出结果行数相同，但不一定顺序一致，要重新排序
tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f1 | rush -j 1 \
'tail -n+2 temp/kraken2/{1}.mpa | LC_ALL=C sort | cut -f 2 | sed "1 s/^/{1}\n/" > temp/kraken2/{1}_count '
# 提取第一样本品行名为表行名
header=`tail -n 1 result/metadata.txt | cut -f 1`
echo $header
tail -n+2 temp/kraken2/${header}.mpa | LC_ALL=C sort | cut -f 1 | \
sed "1 s/^/Taxonomy\n/" > temp/kraken2/0header_count
head -n3 temp/kraken2/0header_count
# paste合并样本为表格
ls temp/kraken2/*count
paste temp/kraken2/*count > result/kraken2/tax_count.mpa
# 检查表格及统计
csvtk -t stat result/kraken2/tax_count.mpa
head -n 5 result/kraken2/tax_count.mpa
Bracken丰度估计
参数简介：
- -d为数据库，-i为输入kraken2报告文件
- r是读长，此处为100，通常为150，o输出重新估计的值
- l为分类级，可选域D、门P、纲C、目O、科F、属G、种S级别丰度估计
- t是阈值，默认为0，越大越可靠，但可用数据越少
循环重新估计每个样品的丰度，请修改tax分别重新计算P和S各1次
# 设置估算的分类级别D,P,C,O,F,G,S，常用门P和种S
# 测序6G起样本-t 10过滤低丰度物种
tax=S
mkdir -p temp/bracken
for i in `tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f1`;do
# i=C1
bracken -d ${db}/kraken2/pluspf16g/ \
-i temp/kraken2/${i}.report \
-r 100 -l ${tax} -t 0 \
-o temp/bracken/${i}.brk \
-w temp/bracken/${i}.report; done
# bracken结果合并成表: 需按表头排序，提取第6列reads count，并添加样本名
tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f1 | rush -j 1 \
'tail -n+2 temp/bracken/{1}.brk | LC_ALL=C sort | cut -f6 | sed "1 s/^/{1}\n/" \
> temp/bracken/{1}.count'
# 提取第一样本品行名为表行名
h=`tail -n1 result/metadata.txt|cut -f1`
tail -n+2 temp/bracken/${h}.brk | sort | cut -f1 | \
sed "1 s/^/Taxonomy\n/" > temp/bracken/0header.count
# 检查文件数，为n+1
ls temp/bracken/*count | wc
# paste合并样本为表格，并删除非零行
paste temp/bracken/*count > result/kraken2/bracken.${tax}.txt
# 统计行列，默认去除表头
csvtk -t stat result/kraken2/bracken.${tax}.txt
# 按频率过滤，-r可标准化，-e过滤(microbiome_helper)
Rscript ${db}/EasyMicrobiome/script/filter_feature_table.R \
-i result/kraken2/bracken.${tax}.txt \
-p 0.01 \
-o result/kraken2/bracken.${tax}.0.01
csvtk -t stat result/kraken2/bracken.${tax}.0.01
个性化结果筛选
# 门水平去除脊索动物(人)
grep 'Chordata' result/kraken2/bracken.P.0.01
grep -v 'Chordata' result/kraken2/bracken.P.0.01 > result/kraken2/bracken.P.0.01-H
# 按物种名手动去除宿主污染，以人为例(需按种水平计算相关结果)
# 种水平去除人类P:Chordata,S:Homo sapiens
grep 'Homo sapiens' result/kraken2/bracken.S.0.01
grep -v 'Homo sapiens' result/kraken2/bracken.S.0.01 \
> result/kraken2/bracken.S.0.01-H
分析后清理每条序列的注释大文件
/bin/rm -rf temp/kraken2/*.output
多样性和可视化
alpha多样性计算：Berger Parker’s (BP), Simpson’s (Si), inverse Simpson’s (ISi), Shannon’s (Sh) # Fisher’s (F)依赖scipy.optimize包，默认未安装
mkdir -p result/kraken2
echo -e "SampleID\tBerger Parker\tSimpson\tinverse Simpson\tShannon" > result/kraken2/alpha.txt
for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do
echo -e -n "$i\t" >> result/kraken2/alpha.txt
for a in BP Si ISi Sh;do
alpha_diversity.py -f temp/bracken/${i}.brk -a $a | cut -f 2 -d ':' | tr '\n' '\t' >> result/kraken2/alpha.txt
done
echo "" >> result/kraken2/alpha.txt
done
cat result/kraken2/alpha.txt
beta多样性计算
beta_diversity.py -i temp/bracken/*.brk --type bracken \
> result/kraken2/beta.txt
cat result/kraken2/beta.txt
Krona图
for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do
kreport2krona.py -r temp/bracken/${i}.report -o temp/bracken/${i}.krona --no-intermediate-ranks
ktImportText temp/bracken/${i}.krona -o result/kraken2/krona.${i}.html
done
Pavian桑基图：fbreitwieser.shinyapps.io/pavian/ 在线可视化:，左侧菜单，Upload sample set (temp/bracken/*.report)，支持多样本同时上传；Sample查看结果，Configure Sankey配置图样式，Save Network下载图网页
多样性分析/物种组成，详见3StatPlot.sh，Kraken2结果筛选序列见附录
三、组装分析流程 Assemble-based
组装
# 启动工作环境
conda activate megahit
MEGAHIT组装Assembly
# 删除旧文件夹，否则megahit无法运行
# /bin/rm -rf temp/megahit
# 组装，10~30m，TB级数据需几天至几周
megahit -t 3 \
-1 `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|sed 's/^/temp\/hr\//;s/$/_1.fastq/'|tr '\n' ','|sed 's/,$//'` \
-2 `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|sed 's/^/temp\/hr\//;s/$/_2.fastq/'|tr '\n' ','|sed 's/,$//'` \
-o temp/megahit
# 统计大小通常300M~5G，如果contigs太多，可以按长度筛选，降低数据量，提高基因完整度，详见附录megahit
seqkit stat temp/megahit/final.contigs.fa
# 预览重叠群最前6行，前60列字符
head -n6 temp/megahit/final.contigs.fa | cut -c1-60
# 备份重要结果
mkdir -p result/megahit/
ln -f temp/megahit/final.contigs.fa result/megahit/
# 删除临时文件
/bin/rm -rf temp/megahit/intermediate_contigs
(可选)metaSPAdes精细组装
# 精细但使用内存和时间更多，15~65m
/usr/bin/time -v -o metaspades.py.log metaspades.py -t 3 -m 100 \
`tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|sed 's/^/temp\/qc\//;s/$/_1.fastq/'|sed 's/^/-1 /'| tr '\n' ' '` \
`tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|sed 's/^/temp\/qc\//;s/$/_2.fastq/'|sed 's/^/-2 /'| tr '\n' ' '` \
-o temp/metaspades
# 查看软件时间User time和内存Maximum resident set size
cat metaspades.py.log
# 2.3M，contigs体积更大
ls -sh temp/metaspades/contigs.fasta
seqkit stat temp/metaspades/contigs.fasta
# 备份重要结果
mkdir -p result/metaspades/
ln -f temp/metaspades/contigs.fasta result/metaspades/
# 删除临时文件
/bin/rm -rf temp/metaspades
注：metaSPAdes支持二、三代混合组装，见附录，此外还有OPERA-MS组装二、三代方案
QUAST评估
# QUAST评估，生成report文本tsv/txt、网页html、PDF等格式报告
quast.py result/megahit/final.contigs.fa \
-o result/megahit/quast -t 2
# (可选) megahit和metaspades比较
quast.py --label "megahit,metapasdes" \
result/megahit/final.contigs.fa \
result/metaspades/contigs.fasta \
-o result/quast
# (可选)metaquast评估，更全面，但需下载相关数据库，受网速影响可能时间很长(经常失败)
# metaquast based on silva, and top 50 species genome, 18min
time metaquast.py result/megahit/final.contigs.fa \
-o result/megahit/metaquast
3.2 基因预测、去冗余和定量Gene prediction, cluster & quantitfy
metaProdigal基因预测Gene prediction
# 输入文件：组装的序列 result/megahit/final.contigs.fa
# 输出文件：prodigal预测的基因序列 temp/prodigal/gene.fa
# 基因大，可参考附录prodigal拆分基因文件，并行计算
mkdir -p temp/prodigal
# prodigal的meta模式预测基因，>和2>&1记录分析过程至gene.log
prodigal -i result/megahit/final.contigs.fa \
-d temp/prodigal/gene.fa \
-o temp/prodigal/gene.gff \
-p meta -f gff > temp/prodigal/gene.log 2>&1
# 查看日志是否运行完成，有无错误
tail temp/prodigal/gene.log
# 统计基因数量
seqkit stat temp/prodigal/gene.fa
# 统计完整基因数量，数据量大可只用完整基因部分
grep -c 'partial=00' temp/prodigal/gene.fa
# 提取完整基因(完整片段获得的基因全为完整，如成环的细菌基因组)
grep 'partial=00' temp/prodigal/gene.fa | cut -f1 -d ' '| sed 's/>//' > temp/prodigal/full_length.id
seqkit grep -f temp/prodigal/full_length.id temp/prodigal/gene.fa > temp/prodigal/full_length.fa
seqkit stat temp/prodigal/full_length.fa
cd-hit基因聚类/去冗余cluster & redundancy
# 输入文件：prodigal预测的基因序列 temp/prodigal/gene.fa
# 输出文件：去冗余后的基因和蛋白序列：result/NR/nucleotide.fa, result/NR/protein.fa
mkdir -p result/NR
# aS覆盖度，c相似度，G局部比对，g最优解，T多线程，M内存0不限制
# 2万基因2m，2千万需要2000h，多线程可加速
cd-hit-est -i temp/prodigal/gene.fa \
-o result/NR/nucleotide.fa \
-aS 0.9 -c 0.95 -G 0 -g 0 -T 0 -M 0
# 统计非冗余基因数量，单次拼接结果数量下降不大，多批拼接冗余度高
grep -c '>' result/NR/nucleotide.fa
# 翻译核酸为对应蛋白序列, --trim去除结尾的*
seqkit translate --trim result/NR/nucleotide.fa \
> result/NR/protein.fa
# 两批数据去冗余使用cd-hit-est-2d加速，见附录
salmon基因定量quantitfy
# 输入文件：去冗余后的基因序列：result/NR/nucleotide.fa
# 输出文件：Salmon定量：result/salmon/gene.count, gene.TPM
mkdir -p temp/salmon
salmon -v # 1.8.0
# 建索引, -t序列, -i 索引，10s
salmon index -t result/NR/nucleotide.fa \
-p 3 -i temp/salmon/index
# 定量，l文库类型自动选择，p线程，--meta宏基因组模式, 2个任务并行2个样
tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f1 | rush -j 2 \
"salmon quant -i temp/salmon/index -l A -p 3 --meta \
-1 temp/qc/{1}_1.fastq -2 temp/qc/{1}_2.fastq \
-o temp/salmon/{1}.quant"
# 合并
mkdir -p result/salmon
salmon quantmerge --quants temp/salmon/*.quant \
-o result/salmon/gene.TPM
salmon quantmerge --quants temp/salmon/*.quant \
--column NumReads -o result/salmon/gene.count
sed -i '1 s/.quant//g' result/salmon/gene.*
# 预览结果表格
head -n3 result/salmon/gene.*
3.3 功能基因注释Functional gene annotation
# 输入数据：上一步预测的蛋白序列 result/NR/protein.fa
# 中间结果：temp/eggnog/protein.emapper.seed_orthologs
# temp/eggnog/output.emapper.annotations
# temp/eggnog/output
# COG定量表：result/eggnog/cogtab.count
# result/eggnog/cogtab.count.spf (用于STAMP)
# KO定量表：result/eggnog/kotab.count
# result/eggnog/kotab.count.spf (用于STAMP)
# CAZy碳水化合物注释和定量：result/dbcan3/cazytab.count
# result/dbcan3/cazytab.count.spf (用于STAMP)
# 抗生素抗性：result/resfam/resfam.count
# result/resfam/resfam.count.spf (用于STAMP)
# 这部分可以拓展到其它数据库
eggNOG基因注释gene annotation(COG/KEGG/CAZy)
# 运行并记录软件版本
conda activate eggnog
emapper.py --version
# emapper-2.1.7 / Expected eggNOG DB version: 5.0.2
# Diamond version found: diamond version 2.0.15
# 运行emapper，18m，默认diamond 1e-3
mkdir -p temp/eggnog
time emapper.py --data_dir ${db}/eggnog \
-i result/NR/protein.fa --cpu 3 -m diamond --override \
-o temp/eggnog/output
# 格式化结果并显示表头
grep -v '^##' temp/eggnog/output.emapper.annotations | sed '1 s/^#//' \
> temp/eggnog/output
csvtk -t headers -v temp/eggnog/output
# 生成COG/KO/CAZy丰度汇总表
mkdir -p result/eggnog
# 显示帮助
summarizeAbundance.py -h
# 汇总，7列COG_category按字母分隔，12列KEGG_ko和19列CAZy按逗号分隔，原始值累加
summarizeAbundance.py \
-i result/salmon/gene.TPM \
-m temp/eggnog/output --dropkeycolumn \
-c '7,12,19' -s '*+,+,' -n raw \
-o result/eggnog/eggnog
sed -i 's#^ko:##' result/eggnog/eggnog.KEGG_ko.raw.txt
sed -i '/^-/d' result/eggnog/eggnog*
head -n3 result/eggnog/eggnog*
# eggnog.CAZy.raw.txt eggnog.COG_category.raw.txt eggnog.KEGG_ko.raw.txt
# 添加注释生成STAMP的spf格式
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"} NR==FNR{a[$1]=$2} NR>FNR{print a[$1],$0}' \
${db}/EasyMicrobiome/kegg/KO_description.txt \
result/eggnog/eggnog.KEGG_ko.raw.txt | \
sed 's/^\t/Unannotated\t/' \
> result/eggnog/eggnog.KEGG_ko.TPM.spf
head -n 5 result/eggnog/eggnog.KEGG_ko.TPM.spf
# KO to level 1/2/3
summarizeAbundance.py \
-i result/eggnog/eggnog.KEGG_ko.raw.txt \
-m ${db}/EasyMicrobiome/kegg/KO1-4.txt \
-c 2,3,4 -s ',+,+,' -n raw --dropkeycolumn \
-o result/eggnog/KEGG
head -n3 result/eggnog/KEGG*
# CAZy
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"} NR==FNR{a[$1]=$2} NR>FNR{print a[$1],$0}' \
${db}/EasyMicrobiome/dbcan2/CAZy_description.txt result/eggnog/eggnog.CAZy.raw.txt | \
sed 's/^\t/Unannotated\t/' > result/eggnog/eggnog.CAZy.TPM.spf
head -n 3 result/eggnog/eggnog.CAZy.TPM.spf
# COG
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"} NR==FNR{a[$1]=$2"\t"$3} NR>FNR{print a[$1],$0}' \
${db}/EasyMicrobiome/eggnog/COG.anno result/eggnog/eggnog.COG_category.raw.txt > \
result/eggnog/eggnog.COG_category.TPM.spf
head -n 3 result/eggnog/eggnog.COG_category.TPM.spf
CAZy碳水化合物酶
# 比对CAZy数据库, 用时2~18m
mkdir -p temp/dbcan3 result/dbcan3
# --sensitive慢10倍，dbcan3e值为1e-102，此处以1e-3演示
time diamond blastp \
--db ${db}/dbcan3/CAZyDB \
--query result/NR/protein.fa \
--threads 2 -e 1e-3 --outfmt 6 --max-target-seqs 1 --quiet \
--out temp/dbcan3/gene_diamond.f6
wc -l temp/dbcan3/gene_diamond.f6
# 提取基因与dbcan分类对应表
format_dbcan2list.pl \
-i temp/dbcan3/gene_diamond.f6 \
-o temp/dbcan3/gene.list
# 按对应表累计丰度，依赖
summarizeAbundance.py \
-i result/salmon/gene.TPM \
-m temp/dbcan3/gene.list \
-c 2 -s ',' -n raw --dropkeycolumn \
-o result/dbcan3/TPM
# 添加注释生成STAMP的spf格式，结合metadata.txt进行差异比较
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"} NR==FNR{a[$1]=$2} NR>FNR{print a[$1],$0}' \
${db}/EasyMicrobiome/dbcan2/CAZy_description.txt result/dbcan3/TPM.CAZy.raw.txt | \
sed 's/^\t/Unannotated\t/' \
> result/dbcan3/TPM.CAZy.raw.spf
head result/dbcan3/TPM.CAZy.raw.spf
# 检查未注释数量，有则需要检查原因
grep 'Unannotated' result/dbcan3/TPM.CAZy.raw.spf|wc -l
CARD耐药基因
CARD在线分析平台：card.mcmaster.ca/ 本地软件使用教程: github.com/arpcard/rgi 参考文献：doi.org/10.1093/nar… 结果说明：protein.json，在线可视化；protein.txt，注释基因列表
mkdir -p result/card
# 启动rgi环境和记录版本
conda activate rgi6
rgi main -v # 6.0.3
# 简化蛋白ID
cut -f 1 -d ' ' result/NR/protein.fa > temp/protein.fa
# 这个错误忽略即可，不是报错，没有任何影响 grep: 写错误: 断开的管道
grep '>' result/NR/protein.fa | head -n 3
grep '>' temp/protein.fa | head -n 3
# 蛋白层面注释ARG
rgi main -i temp/protein.fa -t protein \
-n 9 -a DIAMOND --include_loose --clean \
-o result/card/protein
head -n3 result/card/protein.txt
# 基因层面注释ARG
cut -f 1 -d ' ' result/NR/nucleotide.fa > temp/nucleotide.fa
grep '>' temp/nucleotide.fa | head -n3
rgi main -i temp/nucleotide.fa -t contig \
-n 9 -a DIAMOND --include_loose --clean \
-o result/card/nucleotide
head -n3 result/card/nucleotide.txt
# 重叠群层面注释ARG
cut -f 1 -d ' ' result/megahit/final.contigs.fa > temp/contigs.fa
grep '>' temp/contigs.fa | head -n3
rgi main -i temp/contigs.fa -t contig \
-n 9 -a DIAMOND --include_loose --clean \
-o result/card/contigs
head result/card/contigs.txt
3.4 基因物种注释
# Generate report in default taxid output
conda activate kraken2
kraken2 --db ${db}/kraken2/pluspf16g \
result/NR/nucleotide.fa \
--threads 3 \
--report temp/NRgene.report \
--output temp/NRgene.output
# Genes & taxid list
grep '^C' temp/NRgene.output | cut -f 2,3 | sed '1 i Name\ttaxid' \
> temp/NRgene.taxid
# Add taxonomy
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"} NR==FNR{a[$1]=$0} NR>FNR{print $1,a[$2]}' \
$db/EasyMicrobiome/kraken2/taxonomy.txt \
temp/NRgene.taxid > result/NR/nucleotide.tax
conda activate eggnog
summarizeAbundance.py \
-i result/salmon/gene.TPM \
-m result/NR/nucleotide.tax --dropkeycolumn \
-c '2,3,4,5,6,7,8,9' -s ',+,+,+,+,+,+,+,' -n raw \
-o result/NR/tax
wc -l result/NR/tax*|sort -n
四、分箱挖掘单菌基因组Binning
4.1 MetaWRAP混合样本分箱 Samples binning
挖掘单菌基因组，需要研究对象复杂度越低、测序深度越大，结果质量越好。要求单样本6GB+，复杂样本如土壤推荐数据量30GB+，至少3个样本
演示数据12个样仅140MB，无法获得单菌基因组，这里使用官方测序数据演示讲解
软件和数据库布置需1-3天，演示数据分析过程超10h，30G样也需1-30天，由服务器性能决定。
# 设置并进入工作目录
wd=~/meta/binning
mkdir -p ${wd} && cd ${wd}
# 初始化项目
mkdir -p temp/hr seq result
# 启动metawrap环境
conda activate metawrap
数据和环境变量 Data and enviroment
这里基于质控clean数据和拼接好的重叠群contigs，基于上游结果继续分析。由于上游测试数据过小，分箱无结果。 本次采用软件推荐的7G数据，我们进入一个新文件夹开展分析。
输入输出文件介绍：
# 输入：质控后序列，文件名格式为*_1.fastq和*_2.fastq，temp/qc 目录下，如C1_1.fastq、C1_2.fastq
# 组装的重叠群文件：result/megahit/final.contigs.fa
# 输出：
# Binning结果：temp/binning
# 提纯后的Bin统计结果：temp/bin_refinement/metawrap_50_10_bins.stats
# Bin定量结果文件和图：binning/temp/bin_quant/bin_abundance_table.tab 和 bin_abundance_heatmap.png
# Bin物种注释：binning/temp/bin_classify/bin_taxonomy.tab
# Prokka基因预测：binning/temp/bin_annotate/prokka_out/bin.*.ffn 核酸序列
# Bin可视化图表：binning/temp/bloblogy/final.contigs.binned.blobplot (数据表) 和 blobplot_figures (可视化图)
准备输入文件：原始数据+组装结果
# 质控后数据位于temp/qc中，此处需下载并解压
# 方法1. 直接拷贝
/bin/cp -rf /db/metawrap/*.fastq ~/meta/binning/temp/hr/
# 方法2. 在线下载
cd temp/hr
for i in `seq 7 9`;do
wget -c ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/ERR011/ERR01134${i}/ERR01134${i}_1.fastq.gz
wget -c ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/ERR011/ERR01134${i}/ERR01134${i}_2.fastq.gz
done
gunzip -k *.gz
# 批量修改扩展名fq为fastq
# rename .fq .fastq *.fq
# megahit拼接结果
cd ${wd}
mkdir -p temp/megahit
cd temp/megahit
# 可从EasyMetagenome目录复制，或链接下载
wget -c http://www.imeta.science/db/metawrap/final.contigs.fa.gz
gunzip -k *.gz
cd ${wd}
分箱Binning
# 加载运行环境
cd ${wd}
conda activate metawrap
metawrap -v # 1.3.2
# 输入文件为contig和clean reads
# 调用maxbin2, metabat2，8p线程2h，24p耗时1h；-concoct 3h
nohup metawrap binning -o temp/binning \
-t 3 -a temp/megahit/final.contigs.fa \
--metabat2 --maxbin2 \
temp/hr/*.fastq
# --concoct > /dev/null 2>&1 增加3~10倍计算量，添加/dev/null清除海量Warning信息
分箱提纯Bin refinement
# 8线程2h， 24p 1.3h；2方法16p 20m
metawrap bin_refinement \
-o temp/bin_refinement \
-A temp/binning/metabat2_bins/ \
-B temp/binning/maxbin2_bins/ \
-c 50 -x 10 -t 8
# -C temp/binning/concoct_bins/ \
# 统计高质量Bin的数量，2方法6个，3方法9个
tail -n+2 temp/bin_refinement/metawrap_50_10_bins.stats|wc -l
# 分析比较图见 temp/bin_refinement/figures/
所有分箱至同一目录All bins in one directory
mkdir -p temp/drep_in
# 混合组装分箱链接和重命名
ln -s `pwd`/temp/bin_refinement/metawrap_50_10_bins/bin.* temp/drep_in/
ls -l temp/drep_in/
# 改名CentOS
rename 'bin.' 'Mx_All_' temp/drep_in/bin.*
# 改名Ubuntu
rename s/bin./Mx_All_/ temp/drep_in/bin.*
ls temp/drep_in/Mx*
(可选Opt)单样本分箱Single sample binning
多样本受硬件、计算时间限制无法完成时，需要单样本组装、分箱。多样本信息丰度，分箱结果更多，更容易降低污染。详见：- Nature Methods | 单样本与多样本宏基因组分箱的比较揭示了广泛存在的隐藏性污染
设置全局线程、并行任务数和筛选分箱的条件
# p:threads线程数,job任务数,complete完整度x:contaminate污染率
conda activate metawrap
p=16
j=3
c=50
x=10
(可选)并行需要样本列表，请提前编写metadata.txt保存于result中
# 快速读取文件生成样本ID列表再继续编写
ls temp/hr/ | grep _1 | cut -f 1 -d '_' | sort -u | sed '1 i SampleID' > result/metadata.txt
# 预览
cat result/metadata.txt
组装Assemble
单样本并行组装；支持中断继续运行
tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|rush -j ${j} \
"metawrap assembly -m 200 -t ${p} --megahit \
-1 temp/hr/{}_1.fastq -2 temp/hr/{}_2.fastq \
-o temp/megahit/{}"
分箱binning
单样本并行分箱，192p, 15m (concoct使用超多线程)；16p 2d/sample, >/dev/null 16p 12h/sample
time tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|rush -j ${j} \
"metawrap binning \
-o temp/binning/{} -t ${p} \
-a temp/megahit/{}/final_assembly.fasta \
--metabat2 --maxbin2 --concoct \
temp/hr/{}_*.fastq > /dev/null 2>&1"
分箱提纯bin refinement
time tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|rush -j ${j} \
"metawrap bin_refinement \
-o temp/bin_refinement/{} -t ${p} \
-A temp/binning/{}/metabat2_bins/ \
-B temp/binning/{}/maxbin2_bins/ \
-C temp/binning/{}/concoct_bins/ \
-c ${c} -x ${x} "
# 分别为1,2,2个
tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|rush -j 1 \
"tail -n+2 temp/bin_refinement/{}/metawrap_50_10_bins.stats|wc -l "
单样品分箱链接和重命名
for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do
ln -s `pwd`/temp/bin_refinement/${i}/metawrap_50_10_bins/bin.* temp/drep_in/
# CentOS
rename 'bin.' "Sg_${i}_" temp/drep_in/bin.*
# Ubuntu
rename "s/bin./Sg_${i}_/" temp/drep_in/bin.*
done
# 删除空白中无效链接
/bin/rm -f temp/drep_in/*\*
# 统计混合和单样本来源数据，10个混，5个单；不同系统结果略有差异
ls temp/drep_in/|cut -f 1 -d '_'|uniq -c
# 统计混合批次/单样本来源
ls temp/drep_in/|cut -f 2 -d '_'|cut -f 1 -d '.' |uniq -c
(可选Opt)分组分箱 Subgroup binning
样本>30或数据量>300G在1TB内存胖结点上完成混合组装和分箱可能内存不足、且时间>1周甚至1月，需要对研究相近条件、地点进行分小组，且每组编写一个metadata??.txt。
conda activate metawrap
# 小组ID: A1/A2/A3
g=A1
组装Assemble：<30个或<300G样本，~12h
metawrap assembly -m 600 -t 32 --megahit \
-1 `tail -n+2 result/metadata${g}.txt|cut -f1|sed 's/^/temp\/hr\//;s/$/_1.fastq/'|tr '\n' ','|sed 's/,$//'` \
-2 `tail -n+2 result/metadata${g}.txt|cut -f1|sed 's/^/temp\/hr\//;s/$/_2.fastq/'|tr '\n' ','|sed 's/,$//'` \
-o temp/megahit_${g}
分箱Binning，~18h
# 链接文件到临时位置
mkdir -p temp/${g}/
for i in `tail -n+2 result/metadata${g}.txt|cut -f1`;do
ln -s `pwd`/temp/hr/${i}*.fastq temp/${g}/
done
# 按组分箱
metawrap binning -o temp/binning_${g} \
-t 32 -a temp/megahit_${g}/final_assembly.fasta \
--metabat2 --maxbin2 \
temp/${g}/*.fastq
分箱提纯Bin refinement
metawrap bin_refinement \
-o temp/bin_refinement_${g} \
-A temp/binning_${g}/metabat2_bins/ \
-B temp/binning_${g}/maxbin2_bins/ \
-c 50 -x 10 -t 32
# 统计高质量Bin的数量
wc -l temp/bin_refinement_${g}/metawrap_50_10_bins.stats
改名汇总 Rename & merge
mkdir -p temp/drep_in
# 混合组装分箱链接和重命名
ln -s `pwd`/temp/bin_refinement_${g}/metawrap_50_10_bins/bin.* temp/drep_in/
# 改名
rename "s/bin./Gp_${g}_/" temp/drep_in/bin.* # Ubuntu
# rename 'bin.' "Gp_${g}_" temp/drep_in/bin.* # CentOS
# 统计
mkdir -p result/bin
echo -n $g >> result/bin/groupNo.txt
ls temp/drep_in/Gp_${g}_*|wc>> result/bin/groupNo.txt
cat result/bin/groupNo.txt
4.2 dRep去冗余种/株基因组集
# 进入虚拟环境drep和工作目录
conda activate drep
cd ${wd}
按种水平去冗余：6~40min，15个为10个，8个来自混拼，2个来自单拼
mkdir -p temp/drep95
# /bin/rm -rf temp/drep95/data/checkM
time dRep dereplicate temp/drep95/ \
-g temp/drep_in/*.fa \
-sa 0.95 -nc 0.30 -comp 50 -con 10 -p 5
# 报错日志在temp/drep95/log/cmd_logs中查看，加-d显示更多
ls temp/drep95/dereplicated_genomes/|cut -f 1 -d '_'|sort|uniq -c
主要结果temp/drep95中：
- 非冗余基因组集：temp/drep95/dereplicated_genomes/*.fa
- 聚类信息表：temp/drep95/data_tables/Cdb.csv
- 聚类和质量图：temp/drep95/figures/clustering
(可选)按株水平99%去冗余，20-30min，本处也为10个
mkdir -p temp/drep99
time dRep dereplicate temp/drep99/ \
-g temp/drep_in/*.fa \
-sa 0.99 -nc 0.30 -comp 50 -con 10 -p 5
ls -l temp/drep99/dereplicated_genomes/ | grep '.fa' | wc -l
4.3 CoverM基因组定量
# 启动环境
conda activate coverm
mkdir -p temp/coverm
# (可选)单样本测试, 3min
i=ERR011347
time coverm genome --coupled temp/hr/${i}_1.fastq temp/hr/${i}_2.fastq \
--genome-fasta-directory temp/drep95/dereplicated_genomes/ -x fa \
-o temp/coverm/${i}.txt
cat temp/coverm/${i}.txt
# 并行计算, 4min
tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|rush -j 2 \
"coverm genome --coupled temp/hr/{}_1.fastq temp/hr/{}_2.fastq \
--genome-fasta-directory temp/drep95/dereplicated_genomes/ -x fa \
-o temp/coverm/{}.txt"
# 结果合并
mkdir -p result/coverm
conda activate humann3
sed -i 's/_1.fastq Relative Abundance (%)//' temp/coverm/*.txt
humann_join_tables --input temp/coverm \
--file_name txt \
--output result/coverm/abundance.tsv
# 按组求均值，需要metadata中有3列且每个组有多个样本
Rscript ${db}/EasyMicrobiome/script/otu_mean.R --input result/coverm/abundance.tsv \
--metadata result/metadata.txt \
--group Group --thre 0 \
--scale TRUE --zoom 100 --all TRUE --type mean \
--output result/coverm/group_mean.txt
# https://www.bic.ac.cn/ImageGP/ 直接选择热图可视化
4.4 GTDB-tk物种注释和进化树
启动软件所在虚拟环境
conda activate gtdbtk2.3
export GTDBTK_DATA_PATH="${db}/gtdb"
gtdbtk -v # 2.3.2
代表性细菌基因组物种注释
mkdir -p temp/gtdb_classify
# 10个基因组，24p，100min 152G内存; 6p, 22基因组，1h
gtdbtk classify_wf \
--genome_dir temp/drep95/dereplicated_genomes \
--out_dir temp/gtdb_classify \
--extension fa --skip_ani_screen \
--prefix tax \
--cpus 6
# less -S按行查看，按q退出
less -S temp/gtdb_classify/tax.bac120.summary.tsv
less -S temp/gtdb_classify/tax.ar53.summary.tsv
代表种注释：以上面鉴定的10个种为例，注意扩展名要与输入文件一致，可使用压缩格式gz。主要结果文件描述：此9个细菌基因组在tax.bac120.summary.tsv。古菌在tax.ar53开头的文件中。
(可选)所有MAG物种注释
mkdir -p temp/gtdb_all
# 10000个基因组，32p，100min
time gtdbtk classify_wf \
--genome_dir temp/drep_in/ \
--out_dir temp/gtdb_all \
--extension fa --skip_ani_screen \
--prefix tax \
--cpus 6
less -S temp/gtdb_all/tax.bac120.summary.tsv
less -S temp/gtdb_all/tax.ar53.summary.tsv
多序列对齐结果建树
# 以9个细菌基因组的120个单拷贝基因建树，1s
mkdir -p temp/gtdb_infer
gtdbtk infer --msa_file temp/gtdb_classify/align/tax.bac120.user_msa.fasta.gz \
--out_dir temp/gtdb_infer --prefix tax --cpus 3
树文件tax.unrooted.tree可使用iTOL在线美化，也可使用GraphLan本地美化。
制作树注释文件：以gtdb-tk物种注释(tax.bac120.summary.tsv)和drep基因组评估(Widb.csv)信息为注释信息
mkdir -p result/itol
# 制作分类学表
tail -n+2 temp/gtdb_classify/tax.bac120.summary.tsv|cut -f 1-2|sed 's/;/\t/g'|sed '1 s/^/ID\tDomain\tPhylum\tClass\tOrder\tFamily\tGenus\tSpecies\n/' \
> result/itol/tax.txt
head result/itol/tax.txt
# 基因组评估信息
sed 's/,/\t/g;s/.fa//' temp/drep95/data_tables/Widb.csv|cut -f 1-7,11|sed '1 s/genome/ID/' \
> result/itol/genome.txt
head result/itol/genome.txt
# 整合注释文件
awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"} NR==FNR{a[$1]=$0} NR>FNR{print $0,a[$1]}' result/itol/genome.txt result/itol/tax.txt|cut -f 1-8,10- > result/itol/annotation.txt
head result/itol/annotation.txt
# 添加各样本相对丰度(各组替换均值)
awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"} NR==FNR{a[$1]=$0} NR>FNR{print $0,a[$1]}' <(sed '1 s/Genome/ID/' result/coverm/abundance.tsv) result/itol/annotation.txt|cut -f 1-15,17- > result/itol/annotation2.txt
head result/itol/annotation2.txt
CheckM2重新评估
conda activate checkm2
mkdir -p temp/checkm2 result/checkm2
# 10 genomes, 2m
time checkm2 predict --input temp/drep95/dereplicated_genomes/* --output-directory temp/checkm2 --threads 8
ln temp/checkm2/quality_report.tsv result/checkm2/
# 查看结果
less result/checkm2//quality_report.tsv
5 (可选)单菌基因组
5.1 Fastp质量控制
# 每个样本~30s，173个j2共
mkdir -p temp/qc/
time tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f1 | rush -j 2 \
"time fastp -i seq/{1}_1.fq.gz -I seq/{1}_2.fq.gz \
-j temp/qc/{1}_fastp.json -h temp/qc/{1}_fastp.html \
-o temp/qc/{1}_1.fastq -O temp/qc/{1}_2.fastq \
> temp/qc/{1}.log 2>&1"
5.2 metaspades组装
conda activate megahit
spades.py -v # v3.15.4，>3.14.0才支持--isolate模式
mkdir -p temp/spades result/spades
# 127 genoms, 1m17s
time tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|rush -j 3 \
"spades.py --pe1-1 temp/qc/{1}_1.fastq \
--pe1-2 temp/qc/{1}_2.fastq \
-t 16 --isolate --cov-cutoff auto \
-o temp/spades/{1}"
# 筛选>1k的序列并汇总、统计
time tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|rush -j 3 \
"seqkit seq -m 1000 temp/spades/{1}/contigs.fasta \
> temp/spades/{1}.fa"
seqkit stat temp/spades/*.fa | sed 's/temp\/spades\///;s/.fa//' > result/spades/stat1k.txt
5.3 checkm质量评估
checkm评估质量
conda activate drep
checkm # CheckM v1.1.2
mkdir -p temp/checkm result/checkm
# 127 genoms, 1m17s
time checkm lineage_wf -t 8 -x fa temp/spades/ temp/checkm
# format checkm jason to tab
checkmJason2tsv.R -i temp/checkm/storage/bin_stats_ext.tsv \
-o temp/checkm/bin_stats.txt
csvtk -t pretty temp/checkm/bin_stats.txt | less
(可选)checkm2评估(测试中...)
conda activate checkm2
mkdir -p temp/checkm2
time checkm2 predict --threads 8 --input temp/spades/ --output-directory temp/checkm2
筛选污染和高质量基因组 >5% contamination and high quailty
awk '$5<90 || $10>5' temp/checkm/bin_stats.txt | csvtk -t cut -f 1,5,10,4,9,2 > temp/checkm/contamination5.txt
tail -n+2 temp/checkm/contamination5.txt|wc -l
# 筛选高质量用于下游分析 <5% high-quality for down-stream analysis
awk '$5>=90 && $10<=5' temp/checkm/bin_stats.txt | csvtk -t cut -f 1,5,10,4,9,2 | sed '1 i ID\tCompleteness\tContamination\tGC\tN50\tsize' > result/checkm/Comp90Cont5.txt
tail -n+2 result/checkm/Comp90Cont5.txt|wc -l
# 链接高质量基因组至新目录，单菌完整度通常>99%
mkdir -p temp/drep_in/
for n in `tail -n+2 result/checkm/Comp90Cont5.txt|cut -f 1`;do
ln temp/spades/${n}.fa temp/drep_in/
done
5.4 混菌metawarp分箱
分箱和提纯binning & refinement
conda activate metawrap
mkdir -p temp/binning temp/bin
time tail -n+2 temp/checkm/contamination5.txt|cut -f1|rush -j 3 \
"metawrap binning \
-o temp/binning/{} -t 8 \
-a temp/spades/{}/contigs.fasta \
--metabat2 --maxbin2 \
temp/qc/{}_*.fastq"
time tail -n+2 temp/checkm/contamination5.txt|cut -f1|rush -j 15 \
"metawrap bin_refinement \
-o temp/bin/{} -t 8 \
-A temp/binning/{}/metabat2_bins/ \
-B temp/binning/{}/maxbin2_bins/ \
-c 50 -x 10"
分箱结果汇总
echo -n -e "" > temp/bin/metawrap.stat
for m in `tail -n+2 temp/checkm/contamination5.txt|cut -f1`;do
echo ${m} >> temp/bin/metawrap.stat
cut -f1-4,6-7 temp/bin/${m}/metawrap_50_10_bins.stats >> temp/bin/metawrap.stat
done
# 分箱后的按b1,b2,b3重命名共培养，单菌也可能减少污染
for m in `tail -n+2 temp/checkm/contamination5.txt|cut -f1`;do
c=1
for n in `tail -n+2 temp/bin/$m/metawrap_50_10_bins.stats|cut -f 1`;do
cp temp/bin/$m/metawrap_50_10_bins/${n}.fa temp/drep_in/${m}b${c}.fa
((c++))
done
done
分箱前后统计比较
# 如107个测序分箱为352个基因组，共418个基因组
tail -n+2 temp/checkm/contamination5.txt|wc -l
ls temp/drep_in/*b?.fa | wc -l
ls temp/drep_in/*.fa | wc -l
# 重建新ID列表，A代表所有，B代表Bin分箱过的单菌
ls temp/drep_in/*.fa|cut -f 3 -d '/'|sed 's/.fa//'|sed '1 i ID'|less -S>result/metadataA.txt
ls temp/drep_in/*b?.fa|cut -f 3 -d '/'|sed 's/.fa//'|sed '1 i ID'|less -S>result/metadataB.txt
可视化混菌中覆盖度分布，以第一污染菌为例
i=`tail -n+2 temp/checkm/contamination5.txt|head -n1|cut -f1`
# grep '>' temp/spades/${i}.fa|cut -f 2,4,6 -d '_'|sed 's/^/C/;s/_/\t/g'|sed '1i Contig\tLength\tCoverage'>temp/spades/${i}.len
grep '>' temp/drep_in/${i}*|cut -f 3 -d '/'|sed 's/.fa:>NODE//'|cut -f 1,2,4,6 -d '_'|sed 's/_/\t/g'|sed '1i Genome\tContig\tLength\tvalue' > temp/drep_in/${i}.cov
sp_lines.sh -f temp/drep_in/${i}.cov -m TRUE -A TRUE -a Contig -H Genome
5.5 drep基因组去冗余
mkdir -p temp/drep95/
conda activate drep
# 相似度sa 0.99995 去重复, 0.99 株水平, 0.95 种水平
dRep dereplicate \
-g temp/drep_in/*.fa \
-sa 0.95 -nc 0.3 -p 16 -comp 50 -con 10 \
temp/drep95
# 统计总和使用基因组数据，确保没有异常丢弃stat total and used genomes, keep no abnormal discard
ls temp/drep_in/*.fa|wc -l
grep 'passed checkM' temp/drep95/log/logger.log|sed 's/[ ][ ]*/ /g'|cut -f 4 -d ' '
# 去冗余后数量，418变为49种
ls temp/drep95/dereplicated_genomes/|wc -l
# 唯一和重复的基因组unique and duplicate genome
csvtk cut -f 11 temp/drep95/data_tables/Widb.csv | sort | uniq -c
# 整理种列表
echo "SampleID" > result/metadataS.txt
ls temp/drep95/dereplicated_genomes/|sed 's/\.fa//' >> result/metadataS.txt
5.6 gtdb物种注释
conda activate gtdbtk2.3
# 所有基因组注释，400g, 1h, 1T
mkdir -p temp/gtdb_all result/gtdb_all
memusg -t gtdbtk classify_wf \
--genome_dir temp/drep_in/ \
--out_dir temp/gtdb_all/ \
--extension fa --skip_ani_screen \
--prefix tax \
--cpus 16
# 基因组信息genomeInfo.csv
sed 's/,/\t/g;s/.fa//' temp/drep95/data_tables/genomeInfo.csv |sed '1 s/genome/ID/' > result/gtdb_all/genome.txt
# 95%聚类种基因组注释，40g, 1h, 500G
mkdir -p temp/gtdb_95 result/gtdb_95
# Taxonomy classify
memusg -t gtdbtk classify_wf \
--genome_dir temp/drep95/dereplicated_genomes/ \
--out_dir temp/gtdb_95 \
--extension fa --skip_ani_screen \
--prefix tax \
--cpus 8
# Phylogenetic tree infer
memusg -t gtdbtk infer \
--msa_file temp/gtdb_95/align/tax.bac120.user_msa.fasta.gz \
--out_dir temp/gtdb_95 \
--cpus 8 --prefix g >> temp/gtdb_95/infer.log 2>&1
ln `pwd`/temp/gtdb_95/infer/intermediate_results/g.unrooted.tree result/gtdb_95/
# 细菌format to standard 7 levels taxonomy
tail -n+2 temp/gtdb_95/classify/tax.bac120.summary.tsv|cut -f 1-2|sed 's/;/\t/g'|sed '1 s/^/ID\tKingdom\tPhylum\tClass\tOrder\tFamily\tGenus\tSpecies\n/' > result/gtdb_95/tax.bac.txt
# 古菌(可选)
tail -n+2 temp/gtdb_95/classify/tax.ar122.summary.tsv|cut -f 1-2|sed 's/;/\t/g'|sed '1 s/^/ID\tKingdom\tPhylum\tClass\tOrder\tFamily\tGenus\tSpecies\n/' > result/gtdb_95/tax.ar.txt
cat result/gtdb_95/tax.bac.txt <(tail -n+2 result/gtdb_95/tax.ar.txt) > result/gtdb_95/tax.txt
# Widb.csv 非冗余基因组信息
sed 's/,/\t/g;s/.fa//' temp/drep95/data_tables/Widb.csv|cut -f 1-7,11|sed '1 s/genome/ID/' > result/gtdb_95/genome.txt
# 整合物种注释和基因组信息 Integrated taxonomy and genomic info
awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"} NR==FNR{a[$1]=$0} NR>FNR{print $0,a[$1]}' result/gtdb_95/genome.txt result/gtdb_95/tax.txt|cut -f 1-8,10- > result/gtdb_95/annotation.txt
# csvtk -t headers -v result/gtdb_95/annotation.txt
# 制作itol files
cd result/gtdb_95
table2itol.R -D plan1 -a -c double -i ID -l Genus -t %s -w 0.5 annotation.txt
table2itol.R -D plan2 -a -d -c none -b Phylum -i ID -l Genus -t %s -w 0.5 annotation.txt
table2itol.R -D plan3 -c keep -i ID -t %s annotation.txt
table2itol.R -D plan4 -a -c factor -i ID -l Genus -t %s -w 0 annotation.txt
# Stat each level
echo -e 'Taxonomy\tKnown\tNew' > tax.stat
for i in `seq 2 8`;do
head -n1 tax.txt|cut -f ${i}|tr '\n' '\t' >> tax.stat
tail -n+2 tax.txt|cut -f ${i}|grep -v '__$'|sort|uniq -c|wc -l|tr '\n' '\t' >> tax.stat
tail -n+2 tax.txt|cut -f ${i}|grep '__$'|wc -l >> tax.stat; done
cat tax.stat
tail -n+2 tax.txt|cut -f3|sort|uniq -c|awk '{print $2"\t"$1}'|sort -k2,2nr > count.phylum
cat count.phylum
cd ../..
5.7 功能注释eggnog/dbcan/arg/antismash
基因注释
mkdir -p temp/prodigal
conda activate eggnog
prodigal -v # V2.6.3
# 50g, 31s, 4m
time tail -n+2 result/metadataS.txt|cut -f1|rush -j 10 \
"prodigal \
-i temp/drep95/dereplicated_genomes/{1}.fa \
-o temp/prodigal/{1}.gff \
-a temp/prodigal/{1}.faa \
-d temp/prodigal/{1}.ffn \
-p single -f gff"
seqkit stat temp/prodigal/*.ffn | sed 's/temp\/prodigal\///;s/\.ffn//;s/[[:blank:]]\{1,\}/\t/g' | cut -f 1,3- \
> result/prodigal.txt
碳水化合物注释
mkdir -p temp/dbcan3 result/dbcan3
time tail -n+2 result/metadataS.txt|cut -f1|rush -j 9 \
"diamond blastp \
--db ${db}/dbcan3/CAZyDB \
--query temp/prodigal/{1}.faa \
--outfmt 6 --threads 8 --quiet --log \
--evalue 1e-102 --max-target-seqs 1 --sensitive \
--block-size 6 --index-chunks 1 \
--out temp/dbcan3/{1}_diamond.f6"
wc -l temp/dbcan3/*.f6|head -n-1|awk '{print $2"\t"$1}'|cut -f3 -d '/'|sed 's/_diamond.f6//'|sed '1 i ID\tCAZy'|less -S > result/dbcan3/gene.count
# format blast2genelist
for i in `tail -n+2 result/metadataS.txt|cut -f1`;do
format_dbcan3list.pl \
-i temp/dbcan3/${i}_diamond.f6 \
-o temp/dbcan3/${i}.list
done
# CAZy type count
for i in `tail -n+2 result/metadataS.txt|cut -f1`;do
tail -n+2 temp/dbcan3/${i}.list|cut -f2|sort|uniq -c|awk '{print $2"\t"$1}'|sed "1 i CAZy\t${i}"|less -S > temp/dbcan3/${i}_CAZy.tsv
done
# merge2table
conda activate humann3
humann_join_tables \
--input temp/dbcan3/ --file_name CAZy \
--output result/dbcan3/cazy.txt
csvtk -t stat result/dbcan3/cazy.txt
# merge to level1
paste <(cut -f1 result/dbcan3/cazy.txt) <(cut -f1 result/dbcan3/cazy.txt|tr '0-9' ' '|sed 's/ //g') | sed '1 s/\tCAZy/\tLevel1/' > result/dbcan3/cazy.L1
summarizeAbundance.py \
-i result/dbcan3/cazy.txt \
-m result/dbcan3/cazy.L1 \
-c 2 -s ',' -n raw --dropkeycolumn \
-o result/dbcan3/sum
# 基因相似度
echo -e 'Name\tCAZy\tIdentity\tGenome' > result/dbcan3/identity.txt
for i in `tail -n+2 result/metadataS.txt|cut -f1`;do
csvtk -t replace -f 2 -p "\d+" -r "" temp/dbcan3/${i}.list | uniq | tail -n+2 | sed "s/$/\t${i}/" >> result/dbcan3/identity.txt
done
csvtk -t stat result/dbcan3/identity.txt
sp_boxplot.sh -f result/dbcan3/identity.txt -m T -F CAZy -d Identity
耐药基因
mkdir -p temp/card result/card
conda activate rgi6
# load database 加载数据库
rgi load -i ${db}/card/card.json \
--card_annotation ${db}/card/card.fasta --local
# Annotation 蛋白注释
# 默认为0, --include_loose 可极大增加结果，519/4657=11.14%; --exclude_nudge结果不变，但jason为空
time for i in `tail -n+2 result/metadataS.txt|cut -f1`;do
# i=X004b2
cut -f 1 -d ' ' temp/prodigal/${i}.faa | sed 's/\*//' > temp/prodigal/protein_${i}.fa
rgi main \
--input_sequence temp/prodigal/protein_${i}.fa \
--output_file temp/card/${i} \
--input_type protein --clean \
--num_threads 8 --alignment_tool DIAMOND > temp/log 2>&1
done
附录：常见分析问题和补充代码
计算时间统计表
在60核(p)及以上服务器，单样本3个并行推荐16p，混合组装分箱推荐32p。
小数据：2个7.5M样本，在72个核、512GB服务器上测试。 大数据：20个10G样本，在192个核、2TB大内存服务器上测试。
| 步骤 | 数据小(6Gx3) | 数据(10Gx20) | 备注 |
|---|---|---|---|
| fastqc | 33s | 15m | |
| seqkit | 2s | 15m | |
| fastp | 2s | 40m | |
| kneaddata | 25s | 5h | |
| humann | 34m | 30h | |
| megahit | 39s | 15h | |
| binning | 6h | 16h | -concoct |
| binrefine | 2h | 3h | |
| coverm | 4m | 30m |
注：m为分，h为小时，d为天
补充代码Supplementary scripts
for循环批量处理样本列表
# 基于样本元数据提取样本列表命令解析
# 去掉表头
tail -n+2 result/metadata.txt
# 提取第一列样本名
tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1
# 循环处理样本
for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do echo "Processing "$i; done
# ` 反引号为键盘左上角Esc键下面的按键，一般在数字1的左边，代表运行命令返回结果
质控去宿主KneadData
双端序列质控后是否配对的检查
双端序列质控后序列数量不一致是肯定出错了。但即使序列数量一致，也可能序列不对。在运行metawrap分箱时会报错。可以kneaddata运行时添加--reorder来尝试解决。以下提供了检查双端序列ID是否配对的比较代码
# 文件
i=C1
seqkit seq -n -i temp/qc/${i}_1_kneaddata_paired_1.fastq|cut -f 1 -d '/' | head > temp/header_${i}_1
seqkit seq -n -i temp/qc/${i}_1_kneaddata_paired_2.fastq|cut -f 1 -d '/' | head > temp/header_${i}_2
cmp temp/header_${i}_?
如果序列双端名称一致，且单样本质控结果异常时使用，适合旧版本：新版全kneaddata 1.12已经将此功能添加至流程，以下代码运行返倒引起错误
序列改名，解决NCBI SRA数据双端ID重名问题，详见《MPB：随机宏基因组测序数据质量控制和去宿主的分析流程和常见问题》。
# 以0.12.0为例，序列中间不一至存在:1和:2会无结果，
@A01909:80:HFT7YDSX5:2:1101:1289:1000 1:N:0:ATGAATAT+TTAAGTGG
@A01909:80:HFT7YDSX5:2:1101:1289:1000 2:N:0:ATGAATAT+TTAAGTGG
# 以0.12.0为例，最终的结果为无空格，结果/1和/2
@A01909:80:HFT7YDSX5:2:1101:1289:1000.1:N:0:ATGAATAT+TTAAGTGG/1
@A01909:80:HFT7YDSX5:2:1101:1289:1000.1:N:0:ATGAATAT+TTAAGTGG/2
# 以单个样本修改
i=A01
sed -i '1~4 s/ 1:/.1:/;1~4 s/$/\/1/' temp/qc/${i}_1.fastq
sed -i '1~4 s/ 2:/.1:/;1~4 s/$/\/2/' temp/qc/${i}_2.fastq
# 批量修改
sed -i '1~4 s/ 1:/.1:/;1~4 s/$/\/1/' temp/qc/${i}_1.fastq
sed -i '1~4 s/ 1:/.1:/;1~4 s/$/\/1/' temp/qc/${i}_2.fastq
Perl环境不匹配
报错'perl binaries are mismatched'的解决
e=~/miniconda3/envs/meta
PERL5LIB=${e}/lib/5.26.2:${e}/lib/5.26.2/x86_64-linux-thread-multi
Java环境错误
出现错误 Unrecognized option: -d64，为版本不匹配——重装Java运行环境解决：
conda install -c cyclus java-jdk
若出现错误 Error message returned from Trimmomatic : Error: Invalid or corrupt jarfile ~/miniconda3/envs/kneaddata/share/trimmomatic/trimmomatic；找不到程序，修改配置文件指定脚本名称
sed -i 's/trimmomatic\*/trimmomatic.jar/' ~/miniconda3/envs/kneaddata/lib/python3.10/site-packages/kneaddata/config.py
Python环境不匹配-找不到包module
ModuleNotFoundError: No module named 'importlib.metadata'
找不到包，一般是环境变量错误，先确定是否正常启动conda环境，没有重复启动 conda activate kneaddata。已启动检测环境变量
echo $PATH
# /public/software/env01/bin:/public/home/liuyongxin/miniconda3/envs/kneaddata/bin:/public/home/liuyongxin/miniconda3/condabin:/usr/local/bin:/usr/bin:/usr/local/sbin:/usr/sbin
确认conda环境是否为第一个路径，此处kneaddata路径前还有更高优先级的目录在前，重设PATH变量，即删除当前conda环境前的所有路径
PATH=/public/home/liuyongxin/miniconda3/envs/kneaddata/bin:/public/home/liuyongxin/miniconda3/condabin:/usr/local/bin:/usr/bin:/usr/local/sbin:/usr/sbin
HUMANN物种功能定量
metaphlan_to_stamp.pl
# 如果出现下面的错误：
# bash: /db/EasyMicrobiome/script/metaphlan_to_stamp.pl: /usr/bin/perl^M: 解释器错误: 没有那个文件或目录
# sed -i 's/\r//' ${db}/EasyMicrobiome/script/*.pl
GraPhlAn图
# metaphlan2 to graphlan
export2graphlan.py --skip_rows 1,2 -i result/metaphlan2/taxonomy.tsv \
--tree temp/merged_abundance.tree.txt \
--annotation temp/merged_abundance.annot.txt \
--most_abundant 1000 --abundance_threshold 20 --least_biomarkers 10 \
--annotations 3,4 --external_annotations 7
# 参数说明见PPT，或运行 export2graphlan.py --help
# graphlan annotation
graphlan_annotate.py --annot temp/merged_abundance.annot.txt \
temp/merged_abundance.tree.txt temp/merged_abundance.xml
# output PDF figure, annoat and legend
graphlan.py temp/merged_abundance.xml result/metaphlan2/graphlan.pdf \
--external_legends
LEfSe差异分析物种
- 输入文件：物种丰度表result/metaphlan2/taxonomy.tsv
- 输入文件：样品分组信息 result/metadata.txt
- 中间文件：整合后用于LefSe分析的文件 result/metaphlan2/lefse.txt，这个文件可以提供给www.ehbio.com/ImageGP 用于在线LefSE分析
- LefSe结果输出：result/metaphlan2/目录下lefse开头和feature开头的文件
前面演示数据仅有2个样本，无法进行差异比较。下面使用result12目录中由12个样本生成的结果表进行演示
# 设置结果目录，自己的数据使用result，演示用result12
result=result12
# 如果没有，请下载演示数据
# wget -c http://www.imeta.science/db/EasyMetagenome/result12.zip
# unzip result12.zip
准备输入文件，修改样本品为组名(可手动修改)
# 预览输出数据
head -n3 $result/metaphlan2/taxonomy.tsv
# 提取样本行，替换为每个样本一行，修改ID为SampleID
head -n1 $result/metaphlan2/taxonomy.tsv|tr '\t' '\n'|sed '1 s/ID/SampleID/' >temp/sampleid
head -n3 temp/sampleid
# 提取SampleID对应的分组Group(假设为metadata.txt中第二列$2)，替换换行\n为制表符\t，再把行末制表符\t替换回换行
awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"}NR==FNR{a[$1]=$2}NR>FNR{print a[$1]}' $result/metadata.txt temp/sampleid|tr '\n' '\t'|sed 's/\t$/\n/' >groupid
cat groupid
# 合并分组和数据(替换表头)
cat groupid <(tail -n+2 $result/metaphlan2/taxonomy.tsv) > $result/metaphlan2/lefse.txt
head -n3 $result/metaphlan2/lefse.txt
方法1. 推荐在线 www.bic.ac.cn/ImageGP/ 中LEfSe一键分析
方法2. LEfSe命令行分析
conda activate lefse
result=result12
# 格式转换为lefse内部格式
lefse-format_input.py $result/metaphlan2/lefse.txt \
temp/input.in -c 1 -o 1000000
# 运行lefse(样本无重复、分组将报错)
run_lefse.py temp/input.in temp/input.res
# 绘制物种树注释差异
lefse-plot_cladogram.py temp/input.res \
$result/metaphlan2/lefse_cladogram.pdf --format pdf
# 绘制所有差异features柱状图
lefse-plot_res.py temp/input.res \
$result/metaphlan2/lefse_res.pdf --format pdf
# 绘制单个features柱状图
# 查看显著差异features，按丰度排序
grep -v '-' temp/input.res | sort -k3,3n
# 手动选择指定feature绘图，如Firmicutes
lefse-plot_features.py -f one --format pdf \
--feature_name "k__Bacteria.p__Firmicutes" \
temp/input.in temp/input.res \
$result/metaphlan2/lefse_Firmicutes.pdf
# 批量绘制所有差异features柱状图
lefse-plot_features.py -f diff \
--archive none --format pdf \
temp/input.in temp/input.res \
$result/metaphlan2/lefse_
HUMAnN2减少输入文件加速
HUMAnN2是计算非常耗时的步骤，如果上百个10G+的样本，有时需要几周至几月的分析。以下介绍两种快速完成分析，而且结果变化不大的方法。替换下面for循环为原文中的“双端合并为单个文件”部分代码
方法1. 软件分析不考虑双端信息，只用一端可获得相近结果，且速度提高1倍。链接质控结果左端高质量至合并目录
for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do
ln -sf `pwd`/temp/hr/${i}_1.fastq temp/concat/${i}.fq
done
方法2. 控制标准样比对时间。测序数据量通常为650G，同一样本分析时间可达10h100h，严重浪费时间而浪费硬盘空间。
可用head对单端分析截取20M序列，即3G，则为80M行
for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do
head -n80000000 temp/qc/${i}_1_kneaddata_paired_1.fastq > temp/concat/${i}.fq
done
metaphlan2无法找到数据库
正常在首次运行时，会自动下载数据库。有时会失败，解决方法：
方法1. 使用软件安装的用户运行一下程序即可下载成功
方法2. 将我们预下载好的数据索引文件，链接到软件安装目录
db=~/db
soft=~/miniconda3
mkdir -p ${soft}/bin/db_v20
ln -s ${db}/metaphlan2/* ${soft}/bin/db_v20/
mkdir -p ${soft}/bin/databases
ln -s ${db}/metaphlan2/* ${soft}/bin/databases/
CRITICAL ERROR: Can not call software version for bowtie2
解决问题思路：
查看文件位置是否处在conda环境中：type bowtie2。如果不在需要手动设置环境变量的顺序，如果位置正确如在(~/miniconda2/envs/humann2/bin/bowtie2)，请往下看；
检测bowtie2运行情况：bowtie2 -h，报错wd.c: loadable library and perl binaries are mismatched (got handshake key 0xde00080, needed 0xed00080)。 错误原因为Perl库版本错误，检查Perl库位置：echo $PERL5LIB，错误原因没有指向环境，并手动修改perl库位置
# 设置你环境变量位置，最好用绝对路径
e=~/miniconda2/envs/humann2
PERL5LIB=${e}/lib/5.26.2:${e}/lib/5.26.2/x86_64-linux-thread-multi
metaphlan_hclust_heatmap.py报错AttributeError: Unknown property axisbg
在网上搜索，axisbg和axis_bgcolor为过时的函数，新版为facecolor，修改为新名称即可 (参考：blog.csdn.net/qq_41185868…)
# 定位文件绝对路径
file=`type metaphlan_hclust_heatmap.py|cut -f 2 -d '('|sed 's/)//'`
# 替换函数名称为新版
sed -i 's/axisbg/facecolor/g' $file
metaphlan2-共有或特有物种网络图
awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"}{if(FNR==1) {for(i=9;i<=NF;i++) a[i]=$i; print "Tax\tGroup"} \
else {for(i=9;i<=NF;i++) if($i>0.05) print "Tax_"FNR, a[i];}}' \
result/metaphlan2/taxonomy.spf > result/metaphlan2/taxonomy_highabundance.tsv
awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"}{if(FNR==1) {print "Tax\tGrpcombine";} else a[$1]=a[$1]==""?$2:a[$1]$2;}END{for(i in a) print i,a[i]}' \
result/metaphlan2/taxonomy_highabundance.tsv > result/metaphlan2/taxonomy_group.tsv
cut -f 2 result/metaphlan2/taxonomy_group.tsv | tail -n +2 | sort -u >group
for i in `cat group`; do printf "#%02x%02x%02x\n" $((RANDOM%256)) $((RANDOM%256)) $((RANDOM%256)); done >colorcode
paste group colorcode >group_colorcode
awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"}ARGIND==1{a[$1]=$2;}ARGIND==2{if(FNR==1) {print $0, "Grpcombinecolor"} else print $0,a[$2]}' \
group_colorcode result/metaphlan2/taxonomy_group.tsv > result/metaphlan2/taxonomy_group2.tsv
awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"}{if(FNR==1) {print "Tax",$1,$2,$3,$4, $5, $6, $7, $8 } else print "Tax_"FNR, $1,$2,$3,$4, $5,$6, $7, $8}' \
result/metaphlan2/taxonomy.spf > result/metaphlan2/taxonomy_anno.tsv
生物标志鉴定LEfSe
lefse-plot_cladogram.py：Unknown property axis_bgcolor
若出现错误 Unknown property axis_bgcolor，则修改lefse-plot_cladogram.py里的ax_bgcolor替换成facecolor即可。
# 查看脚本位置，然后使用RStudio或Vim修改
type lefse-plot_cladogram.py
物种分类Kraken2
合并样本为表格combine_mpa.py
krakentools中combine_mpa.py，需手动安装脚本，且结果还需调整样本名
combine_mpa.py \
-i `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|sed 's/^/temp\/kraken2\//;s/$/.mpa/'|tr '\n' ' '` \
-o temp/kraken2/combined_mpa
序列筛选/去宿主extract_kraken_reads.py
提取非植物33090和动物(人)33208序列、选择细菌2和古菌2157
mkdir -p temp/kraken2_qc
parallel -j 3 \
"/db/script/extract_kraken_reads.py \
-k temp/kraken2/{1}.output \
-r temp/kraken2/{1}.report \
-1 temp/qc/{1}_1_kneaddata_paired_1.fastq \
-2 temp/qc/{1}_1_kneaddata_paired_2.fastq \
-t 33090 33208 --include-children --exclude \
--max 20000000 --fastq-output \
-o temp/kraken2_qc/{1}_1.fq \
-o2 temp/kraken2_qc/{1}_2.fq" \
::: `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`
组装Megahit
序列长度筛选
megahit默认>200，可选 > 500 / 1000 bp，并统计前后变化；如此处筛选 > 500 bp，序列从15万变为3.5万条，总长度从7M下降到3M
mv temp/megahit/final.contigs.fa temp/megahit/raw.contigs.fa
seqkit seq -m 500 temp/megahit/raw.contigs.fa > temp/megahit/final.contigs.fa
seqkit stat temp/megahit/raw.contigs.fa
seqkit stat temp/megahit/final.contigs.fa
数据太大导致程序中断
报错信息：126 - Too many vertices in the unitig graph (8403694648 >= 4294967294), you may increase the kmer size to remove tons
解决方法：需要增加k-mer，如最小k-mer改为29，不行继续增加或将数据分批次组装
添加参数： --k-min 29 --k-max 141 --k-step 20
二三代混合组装
metaspades
# 3G数据，耗时3h
i=SampleA
time metaspades.py -t 48 -m 500 \
-1 seq/${i}_1.fastq -2 seq/${i}L_2.fastq \
--nanopore seq/${i}.fastq \
-o temp/metaspades_${i}
二三代混合组装OPERA-MS
结果卡在第9步polishing，可添加--no-polishing参数跳过此步；短序列只支持成对文件，多个文件需要cat合并
perl ../OPERA-MS.pl \
--short-read1 R1.fastq.gz \
--short-read2 R2.fastq.gz \
--long-read long_read.fastq \
--no-ref-clustering \
--num-processors 32 \
--out-dir RESULTS
二代组装+三代优化
perl ~/soft/OPERA-MS/OPERA-MS.pl \
--contig-file temp/megahit/final.contigs.fa \
--short-read1 R1.fastq.gz \
--short-read2 R2.fastq.gz \
--long-read long_read.fastq \
--num-processors 32 \
--no-ref-clustering \
--no-strain-clustering \
--no-polishing \
--out-dir temp/opera
结果可用quast或seqkit stat统计对二代组装的改进效果
基因序列prodigal
序列拆分并行预测基因
(可选)以上注释大约1小时完成1M个基因的预测。加速可将contigs拆分，并行基因预测后再合并。
# 拆分contigs，按1M条每个文件
n=10000
seqkit split result/megahit/final.contigs.fa -s $n
# 生成拆分文件序列列表
ls result/megahit/final.contigs.fa.split/final.contigs.part_*.fa|cut -f 2 -d '_'|cut -f 1 -d '.' \
> temp/split.list
# 9线程并行基因预测，此步只用单线程且读写强度不大
time parallel -j 9 \
"prodigal -i result/megahit/final.contigs.fa.split/final.contigs.part_{}.fa \
-d temp/gene{}.fa \
-o temp/gene{}.gff -p meta -f gff \
> temp/gene{}.log 2>&1 " \
::: `cat temp/split.list`
# 合并预测基因和gff注释文件
cat temp/gene*.fa > temp/prodigal/gene.fa
cat temp/gene*.gff > temp/prodigal/gene.gff
基因去冗余cd-hit
两批基因合并cd-hit-est-2d
cd-hit-est-2d 两批次构建非冗余基因集
A和B基因集，分别有M和N个非冗余基因，两批数据合并后用cd-hit-est去冗余，计算量是(M + N) X (M + N -1)
cd-hit-est-2d比较，只有M X N的计算量
# 计算B中特有的基因
cd-hit-est-2d -i A.fa -i2 B.fa -o B.uni.fa \
-aS 0.9 -c 0.95 -G 0 -g 0 \
-T 96 -M 0 -d 0
# 合并为非冗余基因集
cat A.fa B.uni.fa > NR.fa
cd-hit合并多批基因salmon索引时提示ID重复
# [error] In FixFasta, two references with the same name but different sequences: k141_2390219_1. We require that all input records have a unique name up to the first whitespace (or user-provided separator) character.
# 错误解决
mv temp/NRgene/gene.fa temp/NRgene/gene.fa.bak
# 15G,2m,4G
seqkit rename temp/NRgene/gene.fa.bak -o temp/NRgene/gene.fa
基因定量salmon
找不到库文件liblzma.so.0
- 报错信息：error while loading shared libraries: liblzma.so.0
- 问题描述：直接运行salmon报告，显示找不到lib库，
- 解决方法：可使用程序完整路径解决问题，
alias salmon="${soft}/envs/metagenome_env/share/salmon/bin/salmon"
基因功能数据库
综合功能注释KEGG描述整理
脚本位于 /db/script 目录，www.kegg.jp/kegg-bin/sh… 下载htext，即为最新输入文件 ko00001.keg
kegg_ko00001_htext2tsv.pl -i ko00001.keg -o ko00001.tsv
# 原核蛋白数据库(需付费购买)建索引
conda activate eggnog
diamond --version # 2.0.13
cd genes/fasta
# 3m, 2G
memusg -t diamond makedb --in prokaryotes.pep.gz \
--db prokaryotes.pep
# ID转换为KO
zless prokaryotes.dat.gz|cut -f1,2|sed "1i Kgene\tKO">prokaryotes.gene2KO
抗生素抗性CARD
# 使用3.1.0和3.1.2均有警告，修改序列名至纯字母数数字也无效
# WARNING 2021-07-08 08:58:00,478 : Exception : <class 'KeyError'> -> '5141' -> Model(1692) missing in database. Please generate new database.
# WARNING 2021-07-08 08:58:00,478 : Exception : <class 'KeyError'> -> '5141' -> Model(1692)
# WARNING 2021-07-08 08:58:00,479 : tetM ---> hsp.bits: 60.8 <class 'float'> ? <class 'str'>
抗生素抗性ResFam
参考文献：doi.org/10.1038/ism…
mkdir -p temp/resfam result/resfam
# 比对至抗生素数据库 1m
time diamond blastp \
--db ${db}/resfam/Resfams-proteins \
--query result/NR/protein.fa \
--threads 9 --outfmt 6 --sensitive \
-e 1e-5 --max-target-seqs 1 --quiet \
--out temp/resfam/gene_diamond.f6
# 提取基因对应抗性基因列表
cut -f 1,2 temp/resfam/gene_diamond.f6 | uniq | \
sed '1 i Name\tResGeneID' > temp/resfam/gene_fam.list
# 统计注释基因的比例, 488/19182=2.5%
wc -l temp/resfam/gene_fam.list result/salmon/gene.count
# 按列表累计丰度
summarizeAbundance.py \
-i result/salmon/gene.TPM \
-m temp/resfam/gene_fam.list \
-c 2 -s ',' -n raw \
-o result/resfam/TPM
# 结果中添加FAM注释，spf格式用于stamp分析
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"} NR==FNR{a[$1]=$4"\t"$3"\t"$2} NR>FNR{print a[$1],$0}' \
${db}/resfam/Resfams-proteins_class.tsv result/resfam/TPM.ResGeneID.raw.txt \
> result/resfam/TPM.ResGeneID.raw.spf
分箱MetaWRAP
Bin refined报错CheckM
Something went wrong with running CheckM. Exiting...
重新运行1次，错误仍在； 删除concoct输入，尝试提纯
MetaWRAP分箱注释Bin classify & annotate
# Taxator-tk对每条contig物种注释，再估计bin整体的物种，11m (用时66 min)
metawrap classify_bins -b temp/bin_refinement/metawrap_50_10_bins \
-o temp/bin_classify -t 3 &
# 注释结果见`temp/bin_classify/bin_taxonomy.tab`
# export LD_LIBRARY_PATH=/conda2/envs/metagenome_env/lib/:${LD_LIBRARY_PATH}
# 这是动态链接库找不到时的一个简单的应急策略
#ln -s /conda2/envs/metagenome_env/lib/libssl.so.1.0.0 .
#ln -s /conda2/envs/metagenome_env/lib/libcrypto.so.1.0.0 .
# 基于prokka基因注释，4m
metaWRAP annotate_bins -o temp/bin_annotate \
-b temp/bin_refinement/metawrap_50_10_bins -t 5
# 每个bin基因注释的gff文件bin_funct_annotations,
# 核酸ffn文件bin_untranslated_genes，
# 蛋白faa文件bin_translated_genes
ls -sh temp/bin_annotate/prokka_out/bin.1/
分箱定量Bin quantify
# 耗时3m，系统用时10m，此处可设置线程，但salmon仍调用全部资源
metawrap quant_bins -b temp/bin_refinement/metawrap_50_10_bins -t 4 \
-o temp/bin_quant -a temp/megahit/final.contigs.fa temp/qc/ERR*.fastq
# 文件名字改变
# 结果包括bin丰度热图`temp/bin_quant/bin_abundance_heatmap.png`
# 原始数据位于`temp/bin_quant/bin_abundance_table.tab`
ls -l temp/bin_quant/bin_abundance_heatmap.png
GTDB的文件名不存在错
# ERROR: ['BMN5'] are not present in the input list of genome to process，但并无此菌，可能是名称 中存在"-"或"."，替换为i
# 修改metadata
sed 's/-/i/;s/\./i/' result/metadatab.txt > result/metadata.txt
# 修改文件名
awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"}{system("mv temp/antismash/"$1".fna temp/antismash/"$2".fna")ll }' <(paste result/metadatab.txt result/metadata.txt|tail -n+2)
版本更新记录
1.08 2020.7.20
- KneadData提供数据预处理双端标签唯一命令，兼容最新版；
- 提供HUMAnN3测试版的安装和分析流程(附录1)；
- eggNOG升级为emapper 2.0和eggNOG 5.0流程，结果列表从13列变为22列，新增CAZy注释。emapper 1.0版本见附录2。
1.09 2020.10.16
- 新增二、三代混合组装OPERA-MS软件使用 (31Megahit)
深知大多数程序员，想要提升技能，往往是自己摸索成长，但自己不成体系的自学效果低效又漫长，而且极易碰到天花板技术停滞不前！
由于文件比较多，这里只是将部分目录截图出来，全套包含大厂面经、学习笔记、源码讲义、实战项目、大纲路线、讲解视频，并且后续会持续更新 详情docs.qq.com/doc/DSmdCdUNwcEJDTXFK
