蛋白定量测定是实验生物学中一种常用的技术，用于测量样品中蛋白质的浓度或总量。这种测定对于生物化学、分子生物学、医学研究等领域非常重要。
图1. 定量蛋白组分析
一、蛋白定量的基本流程包括：
- 样品制备：细胞提取物、组织样品、血清、血浆、尿液或其他包含蛋白质的生物样品。确保样品是干净的，没有杂质。
- 选择测定方法：选择适合你的实验需求的蛋白定量方法。
- 制备标准曲线：制备一系列已知浓度的标准样品，需要标准曲线来测定蛋白质浓度。
- 测定样品：将样品与测定方法中的试剂混合，按照方法要求的步骤进行反应。根据反应产物的颜色、吸光度或其他特性，使用分光光度计或其他相关仪器测量并记录结果。
- 计算蛋白质浓度：根据标准曲线或测定方法的公式，计算出样品中的蛋白质浓度。
二、蛋白定量的常见方法包括：
1、Bradford 蛋白质测定法：
- 原理：这种方法基于柯马斯亮蓝G-250染料与蛋白质结合时所发生的颜色变化。
- 优点：操作简单，灵敏度较高。
- 缺点：受到洗涤剂和其他化学物质的干扰。
2、Lowry 法：
- 原理：基于铜离子在碱性条件下与蛋白质中的多肽键结合，并进一步与Folin-Ciocalteu试剂反应产生颜色变化。
- 优点：适用于较低浓度的蛋白质。
- 缺点：步骤比Bradford法更复杂，且易受其他物质的干扰。
3、BCA法（双缩脲酸法）：
- 原理：与Lowry 法类似，但使用BCA试剂，对铜离子和蛋白质反应更为敏感。
- 优点：适用于微量蛋白质的测定，稳定性好。
- 缺点：需要较长的孵育时间。
4、紫外吸收光谱法：
- 原理：蛋白质中的色氨酸和酪氨酸在紫外光下有特定的吸收峰。
- 优点：快速且不需要添加任何试剂。
- 缺点：对其他物质的吸收干扰敏感，需要较纯净的样品。
5、基于质谱技术的蛋白定量
1）无标记定量
- 原理：不使用化学标签，直接通过分析肽段离子的强度或计数来定量蛋白质。
- 优点：操作简化，适用于广泛的样品类型，无需额外的化学修饰。
- 缺点：对样品制备和质谱操作的质量要求高，数据处理和解释较为复杂。
2）iTRAQ/TMT
- 原理：使用特殊的化学标签对样品中的蛋白质进行标记。在质谱中，标记产生特定的裂解离子，用于定量分析。
- 优点：可以同时分析多个样本，提高了实验的吞吐量。
- 缺点：高成本，数据处理复杂，对实验设计和执行有较高要求。
3）同位素编码亲和标记（ICAT）
- 原理：使用含有不同同位素的化学标签对蛋白质或肽段进行标记，然后利用质谱分析比较不同样本中蛋白质的相对丰度。
- 优点：提供了准确的蛋白质相对量比较，可用于复杂样品。
- 缺点：成本较高，操作复杂，可能无法检测未标记的蛋白质。
4）SWATH-MS
- 原理：基于数据独立采集，通过系统地扫描所有预定质量窗口来收集质谱数据。
- 优点：提供高通量、高重复性的定量信息，适合复杂样品分析。
- 缺点：需要高级的数据处理技术，对仪器性能要求高。
5）多重反应监测（MRM）
- 原理：选择特定的前体离子和产物离子对，用于定量特定肽段或蛋白质。
- 优点：高度特异性，灵敏度高，适合低丰度目标蛋白的定量。
- 缺点：每次只能定量有限数量的目标蛋白，需要事先知道目标蛋白的信息。
