作者 | David C. Miller 等
编译 | 萝卜皮
生物催化，即应用酶解决人类合成问题的应用，已发展成为化学创新的强大技术。在过去的十年中，大自然为酶催化提供了蓝图，化学家利用生物底物引入了创新的活性模式，蛋白质工程师开发了新的工具和算法来调整和改善酶的功能，三重合作伙伴关系揭开了自然酶催化新的前沿。
在本期展望中，我们重点介绍了有助于扩大生物催化范围的跨学科研究的示例，包括通过仿生学的视角探索的酶多功能性概念，以实现超越目前化学催化可能实现的活性和选择性。指出了现代工具，如定向进化、计算蛋白质设计和基于机器学习的蛋白质工程方法，已经并将继续影响酶工程以实现新的生物转化。跨学科的持续合作预计将在未来几年推动生物催化的进一步发展。
探索促进和细化反应性的催化剂是有机化学的核心事业。在过去的一个世纪里，合成方法已经通过日益复杂的催化系统进行了转变，这些催化系统能够对中间体和反应途径进行动力学和立体电子控制。因此，催化被用于合成治疗曾经致命的疾病的药物、使粮食生产能够维持不断增长的人口的农用化学品，以及现代社会的许多其他必需品。
然而，这些显着的进步只是地球化学史上最新的标点符号。在人类化学家着手利用整个元素周期表之前的数十亿年，更不用说制定现代化学的基本原理了，大自然已经建立了一个平台，以氨基酸的形式实现生命过程的催化—— 基于聚合物——酶——其复杂多样的三维结构空间可以通过进化进行采样，以产生可能无穷无尽的催化剂，用于实施各种化学反应。
尽管对人类和自然化学都是共同的，但这些各方对催化剂开发的处理方式不同。酶是一种特殊的大分子，随着时间的推移，它们可以在特定的环境限制下高效地催化特定的转化。它们由一小组构件和辅助因子组装而成，可催化从酯水解和自由基甲基化反应到光合作用和固氮等多种过程。
相比之下，人类开发的催化剂利用整个元素周期表并执行无数类型的反应，包括许多自然界未知的反应。尽管用途广泛，但这些催化剂通常无法与酶的标志速率和选择性相匹配。生物催化正在成为一个跨学科领域，旨在弥合这些能力。蛋白质工程师使我们能够将酶活性导向新功能，以解决化学家面临的合成问题。通过发现用于生物反应的酶来扩展自然界的催化库，将有可能利用酶的稳健速率和精确的选择性来进行更多人类感兴趣的转化。
在大自然的帮助下，化学家和蛋白质工程师之间的合作已经取得了令人瞩目的成功，包括建立新的化学转化。本期展望重点介绍了该领域潜在进展的一些跨学科研究，并确定了将加速化学合成酶未来发展的新方向。
生命系统通过其多样化的化学过程教会了我们很多关于合成的知识，对酶机制的研究一直是发展化学催化原理和理论的基石。
仿生催化是一种寻求模仿生命反应和模拟酶促底物活化的人造催化剂的开发，是合成化学和酶催化之间许多重要合作中的第一个，起源于 1950 年代。
虽然它无法概括酶的快速速率和无与伦比的选择性，但仿生学继续推动合成化学的进步，包括开发自然界尚不知道能进行的催化反应。
将生物学的经验应用于催化的例子包括设计基于酶辅助因子的催化剂（例如，N-杂环卡宾催化）、重新利用生物氧化还原过程中涉及的基本步骤（例如，质子耦合电子转移）以及利用超分子催化来提高有效浓度（例如，基于 β-环糊精的催化剂）。相反，大自然已被证明是一个善于学习的人，仿生催化剂的生物反应已成为教授酶新功能的有效途径。
在细胞色素 P450 单加氧酶的故事中，生物学和化学相互启发、相互启发和相互促进的非凡方式显而易见。自 1960 年代发现以来，含血红素的 P450 酶与分子氧选择性氧化特定 C-H 键的惊人能力已引起更广泛的化学界的关注。
仿生化学家在阐明这些酶的机制方面发挥了关键作用——格罗夫斯和合作者使用四苯基卟啉铁配合物作为合成模型系统的开创性研究阐明了 P450“自由基反弹”机制——而许多其他金属卟啉配合物被发现可以进行氧化反应。
受这些研究和过渡金属催化胺化的相关工作的启发，Breslow 和 Gellman 在 1982 年证明四苯基卟啉铁配合物可以接受氮烯前体并能够进行 C-H 胺化反应。
他们还询问是否可以诱导细胞色素 P450 本身进行酰胺化来代替其正常的氧合。三年后，他们与 Svastits 和 Dawson 合作，证明兔肝微粒体细胞色素 P450-LM3,4 可以接受氮烯前体作为底物来进行 C-H 胺化反应。
尽管这种活性太低而无法综合使用（观察到分子内磺胺化的总周转数 (TTN) 为 2.2），但这一研究路线提供了两个重要的见解：酶可以在其自然范围之外进行反应，化学家可以利用他们的知识从自然界的催化机制中诱导出新的化学。
图示：用于 C-H 插入反应的仿生和酶促氮烯转移。（来源：论文）
下一步，将微量生物活性细化为强大的催化作用，将需要蛋白质工程来训练酶以执行具有标志性速率和选择性的新反应。在这里，大自然教给我们的关于它的催化剂工程过程（进化）的内容与它对催化本身的内容一样多。
在 1970 年的经典著作《自然选择和蛋白质空间的概念》中，John Maynard Smith 提供了一个理论基础，说明通过自然选择进行的蛋白质进化如何在一个既巨大又几乎没有功能序列的序列空间中操作上成为可能。
他认为，为了发生进化，在功能性蛋白质的一组可能的单一突变体中，必须至少存在一个同样具有功能的子代变体（实际上，存在许多这样的变体）。相同的条件适用于子变体的单突变邻域，依此类推。归纳逻辑意味着功能蛋白质的序列空间形成一个连接网络，可以通过单个氨基酸突变访问。
筛选技术和基因工程的进步，尤其是容易出错的聚合酶链式反应（或 PCR），在 1980 年代允许“定向进化”作为工程蛋白质的工具出现：Arnold 使用了 Maynard Smith 的猜想，即自然进化需要在单个突变步骤中具有最小密度的功能蛋白质；他表明通过在随机上坡行走中积累大部分单个氨基酸变化，酶可以朝着用户定义的目标进化。
自从 1990 年代初的首次展示以来，定向进化一直是一种可靠的策略来设计具有改进特性的酶，例如热稳定性、耐受有机助溶剂的能力、催化效率、增加的底物耐受性等等。
但是新的反应呢？目前尚不清楚这种保守的过程如何产生催化新反应的酶。在这里，自然选择用于特定转化的酶可能仍然显示其他活动（可能遵循机械相关途径）的理解发挥了重要作用。
对这种“催化混杂”的理解往往在酶对单一转化具有高度特异性的认识中丢失。虽然酶的生物学功能可能是自然选择的产物，但它的混杂活动——除非对生物体有害——不受选择压力的限制。
事实上，如果在混杂活动变得有益时出现条件，自然选择可能会产生一种新的酶，该酶具有该功能作为其主要支柱。
其实，新的酶会出现，而且它们可以在短时间内出现，例如，当新的食物来源或降解新抗生素或杀虫剂的能力提供了超越其邻居的机会时。这种对酶如何进化和多样化的见解提出了一种诱人的可能性，即人类强加的条件、非自然反应物或人工蛋白质修饰，这些在自然界中要么是不可接近的，要么是不相关的，可能会揭示自然界中从未见过的混杂活动。
只要能够鉴定出一种能够进行所需的从新到自然的转化的酶，就应该有可能指导其进化，将低产、混杂的酶活性详细说明为稳健和高效的生物催化。因为在人类友好的时间尺度上的进化可用于追踪生物活动，在 Breslow 和 Gellman 最初研究酶促氮烯转移近 30 年后，工程酶现在进行高度立体选择性的 C-H 胺化反应，TTN 值为数百到数千 。
仿生铁卟啉催化剂和血红蛋白之间的机制类比导致发现了这些蛋白质支持的其他非天然反应性，例如卡宾转移，甚至没有天然酶功能的血红蛋白（例如，珠蛋白和细胞色素 c）也被设计用于生物卡宾转移活性。
通过这种流形发现的反应包括一些使用化学催化方法未观察到的反应，例如从炔烃形成双环丁烷。
图示：具有新的自然反应模式的生物反应的辅助因子适应的代表性例子。（来源：论文）
富有想象力的化学家现在已经开始发现蛋白质在提供非天然反应物、外部刺激或其他非生物成分时可能支持的其他混杂活动。除了上面讨论的血红蛋白催化的卡宾和氮烯转移之外，另外两个值得注意的例子说明了这种创造性的练习。种类繁多的黄素依赖性蛋白质包括执行无数氧化还原化学的酶。利用丰富的黄素光化学文献，Hyster 和合作者证明了黄素依赖性酶可以在活性位点内影响一系列新的自然光氧化还原自由基转化。
黄素辅因子的可见光激发允许从适当的前体（通常是烷基卤化物）产生自由基，用于随后的自由基反应，实际上将已知的双电子还原酶家族转化为单电子转移反应的生物催化剂。活性位点施加的立体控制允许不对称自由基转化，包括不对称氢原子转移——这是合成化学中的长期挑战。
最近，Zhao 团队和 Hyster 团队探索了这些酶的机械柔韧性，证明了它们对苯乙烯和其他烯烃受体进行不对称加氢烷基化的能力。Hartwig 团队提供了另一个例子，说明惊人的混杂活动如何潜伏在执行最简单反应的酶的活性位点内。
碳酸酐酶催化将水加到二氧化碳中以通过活性位点氢氧化锌中间体生成碳酸。Hartwig 团队证明，用硅烷处理野生型碳酸酐酶可以产生类似的氢化锌中间体。尽管在无水条件下由硅烷和锌盐生成氢化锌是已知的，但在酶活性位点中这种强氢化物的形成是惊人的。该中间体可用于将芳基甲基酮立体选择性还原为仲醇。在上述示例中，仅使用野生型（未突变的）酶经常观察到高活性。
定向进化可以进一步改善酶参数和性能以及底物范围。酶与蛋白质工程相结合的固有机械多功能性为发现新的生物催化剂提供了巨大的潜力。
几份关于新自然生物催化转化的报告强调了自然、合成化学和蛋白质工程之间的这种合作努力的潜力，以克服长期存在的合成挑战。
虽然酶促环丙烷化的发展始于苯乙烯基烯烃作为底物，但定向演化已将范围扩大到未活化的烯烃。值得注意的是，可以实现所有四种非对映异构环丙烷化产物的催化剂控制的立体发散合成。一种工程化的细胞色素 P450 通过在炔烃底物上的两个连续的卡宾加成反应形成双环丁烷产物，证明了酶能够以优异的效率访问高度应变的碳环核心。其他工程化的 P450 酶催化前所未有的不对称氮烯 C-H 插入反应，以在烯丙基和苄基位置获得伯胺。
在该系统中，胺化被认为是通过“未受保护的”铁氮氧化物活性位点中间体进行的，该中间体可以被认为是化合物 I 的氮类似物。在 Hyster 团队研究的 α-酰基自由基和烯烃的加氢烷基化反应中，活性位点中的底物活化是通过自由基前体、烯烃、黄素辅因子和蛋白质支架之间罕见的四元电荷转移复合物实现的，这使得立体感应能够通过具有挑战性的氢原子转移步骤。
这些结果得到了 Zhao 团队在类似的酶促加氢酰化反应中进行的机械工作的证实。最后，Lewis 团队报道了羧酸在侧链烯烃上的对映选择性分子内卤环化，形成手性卤化 γ-内酯。酶活性位点通过限制烯烃底物之间的卤离子转移来防止手性溴离子中间体的外消旋化，从而有助于出色的立体诱导。
图示：选择新自然酶催化的例子。（来源：论文）
这些系统中展示的非凡的新化学通过酶在顺序反应中操作的顺从性而被放大，这些反应在单锅操作中产生巨大的分子复杂性，就像它们在活细胞内一样。生物催化级联过程的最新实例包括默克公司的九酶三步法合成研究性人类免疫缺陷病毒（HIV）治疗药物 islatravir，以及 Deska 团队采用五酶级联的一锅法合成血管蕨内酯 B。
此外，新的自然转化可用于开发体内合成代谢的人工途径。在体外和体内级联中进行精细化学的能力证明了生物催化所具有的独特合成机会，并表明新的自然反应的发现可以作为“即插即用”合成级联的多功能模块。
在大多数这些例子中，仅使用基因编码的酶促机制来识别新活性。人造金属酶领域不断发展，其中开发了新的过渡金属辅助因子以赋予酶新的活性，一旦开发出强大的组装和定向进化方法，有望进一步扩大生物催化剂的反应空间。
我们设计和设计蛋白质的能力的进步，与上面讨论的化学热情同时促进了新生物化学的发现。计算建模一直是实现这一目标的有用工具，而以设计新酶为目标的蛋白质建模在过去二十年中受到了相当大的关注。
2008 年，Röthlisberger 团队计算设计了一种催化非生物性 Kemp 消除的酶，并且改进了最低性能设计以表现出改进的活性。自本报告以来，其他酶已被计算设计用于自然界中代表性有限的反应，包括 Diels-Alderases 和 Morita-Bayliss-Hillmanases。
从头设计的酶的初始活性通常非常低，这反映了我们对该问题的有限理解，但定向进化可以挽救糟糕的设计，以实现更接近天然酶的速率和选择性。
计算设计还可以指导已知酶功能的扩展。例如，作为开发用于合成西格列汀的生物催化工艺路线的活动的一部分，默克公司的研究人员对转氨酶活性位点进行了计算重新设计以接受前西格列汀酮，为定向进化活动提供了一个关键起点。大量可靠地模拟蛋白质以从头生成新酶和重新设计现有酶的方法对于生物催化来说是无价的。
展望未来，利用计算蛋白质设计、下一代测序和机器学习的蛋白质工程新工具将加速我们设计具有新活性的酶的能力。定向进化本质上是不可知的，它经常通过远离活性位点的细微有益突变来提高酶的性能，这对化学家和蛋白质工程师来说是不直观的。然而，这种变化的影响可以通过从数据中学习的计算机算法来预测。机器学习工具使蛋白质结构能够以更高的可靠性从序列中预测出来；将工程序列与功能相关联是下一个重大挑战。
该领域的新工作表明，机器学习定向进化 (MLDE) 可以比目前采用的“贪婪”优化策略更快地实现更高适应度的变体，从而减少实现高性能生物催化剂所需的实验工作量。这些方法可以帮助开发具有互补选择性的酶：MLDE 引导了一种用于 Si-H 插入的单一酶的不同进化，以产生两种具有互补对映选择性的生物催化剂，从而能够获得所需产物的两个对映体。
利用 MLDE 设计用于平行互补立体诱导的酶的能力可以加快生物催化剂的开发，以获得任何所需的立体异构体。这些例子只是这些技术对生物催化作用的开始：机器学习预测非天然底物上反应的酶性能的探索已经开始，我们期望它在生物催化反应发现中发挥作用的时间越早越好。定向进化的加速，加上并行优化具有互补选择性的酶的能力，极大地放大了发现新的自然生物催化转化的影响。
总之，生物催化是合成化学家、蛋白质工程师和大自然之间持续且富有成果的合作。正如大自然教会了我们化学并为我们提供了系统地改进她的催化剂的蓝图一样，事实证明，她的机器在适当的环境下能够高度适应获得新的化学物质。
我们相信科学家们刚刚触及了酶可以实现的化学转化的表面，我们预计生物学的无限惊喜、蛋白质工程技术的日益强大和复杂性以及持续的化学独创性将继续推动生物催化领域的创新。
该文章以「Combining chemistry and protein engineering for new-to-nature biocatalysis」为题，于 2022 年 1 月 12 日发布在《Nature Synthesis》。
